分子生物学研究法(上)优缺点

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1、第五章分子生物学研究方法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术5.1重组DNA技术重组DNA技术（recombinantDNAtechnique）又称遗传工程，在体外重新组合脱氧核糖核酸（DNA）分子，并使它们在适当的细胞中增殖的遗传操作。重组DNA技术一般包括四步：①获得目的基因；②与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；③用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；④对转化子筛选和鉴定。特点：不受亲缘关系限制，为遗传育种和分子遗传学研究开辟了崭新的途径。适用于获取目标基因的表达产物。5.2DNA基本操作技术（1）核酸凝胶电泳技术将某种分子放到特定的电场中，它就会

2、以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态(Polyanions)。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。适用于DNA、RNA片段的分离。缺点：紫外对DNA分子有损伤，染料毒性大。（2）细菌转化与目标DNA分子的增殖细菌转化是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，接

3、受转化DNA的细菌菌株被称做受体菌株。常用的方法：CaCl2法和电击法大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前,必须先用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态(CompetentCells)，Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用。转化载体上一般带有LacZ基因，常用带有不同抗生素的选择性培养基结合α-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。（3）聚合酶链反应技术用于体外快速扩增特定基因或DNA序列最常用的方法。反应体系：模板DNA、PCR引物、四种核苷酸、Mg2+、TaqDNA聚合酶、缓冲液和超纯水。反应过程：DNA解链（变性）、引物和模板相结合（退火）和DNA合成（链的

4、延伸）特点：敏感，特异，快速的核酸分析技术（4）实时定量PCR荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。适用于对目标DNA片段初始浓度的定量分析。优点：与常规PCR相比，其特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等缺点：实验成本较高，影响因素较多，在定量丰度低的不可培养微生物时，其准确性不强。（5）基因组DNA文库构建把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体结合，导入微生物细胞形成克隆，汇集这些克隆的总汇称为基因组DNA文库。可用于分离特定的基因

5、片段、分析特定基因结构、研究基因表达调控、构建全基因组物理图谱和全基因组序列测定。常用λ噬菌体载体，简单快速、易于操作。5.3RNA基本操作技术（1）总RNA的提取总RNA包括mRNA、rRNA、tRNA和一些小RNA（sRNA）总RNA抽提方法很多，常用的方法是异硫氰酸胍-苯酚抽提法。RNA的浓度和纯度可以通过测定OD260/OD280来判定，1.8-2.0在表示提取的RNA纯度较好。在变性的条件下进行RNA的电泳，甲醛是常用的变性剂，电泳后如果rRNA大小完整，而且28SrRNA和18SrRNA亮度接近2:1，mRNA分布均匀，则认为RNA质量较好。（2）mRNA的纯化真核细胞

6、的mRNA分子结构特征是具有5’端帽子结构-m7G和3’端的polyA尾巴。实验常用寡聚（dT）-纤维素柱色谱法获得高纯度mRNA。就是利用mRNA3’端polyA的特点。mRNA在高盐缓冲液下会特异性结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。目前许多商业化的试剂盒可用于mRNA的纯化，如Promega公司的polyATTractmRNA分离系统将生物素标记的寡聚dT引物与细胞总RNA温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白以结合polyAmRNA，通过磁场吸附作用将polyAmRNA从总RNA中分离。（3）cDNA的合成cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。第一链是以m

7、RNA为模板。有反转录酶（oligodT）催化反转录成cDNA。第二链的合成是以第一链为模板，由聚合酶催化合成。反应体系中加入甲基化dCTP，保证新和成的cDNA链被甲基化修饰，以防止构建克隆时被限制性内切酶切割。一般合成的cDNA双链5’端和3’端分别具有EcoRI和XhoI粘性末端，保证它与载体相连时有方向性。（4）cDNA文库的构建常用的质粒载体和噬菌体类载体都能满足cDNA文库的要求，载体的选择要根据该文库的用途来确定。常用的载体是Uni-zapXR载体。文库