《分子生物学研究法》PPT课件

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1、分子生物学研究法一.重组DNA技术概论二.常见的DNA操作技术三.基因克隆技术(狭义)四.基因表达研究技术五.基因芯片及数据分析六.蛋白质组学及其研究技术一.重组DNA技术概论二.常见的DNA操作技术2.1琼脂糖凝胶电泳2.2SDS-PAGE电泳2.3PCR技术2.4测序技术2.5杂交技术2.6ELISA技术2.7细菌转化2.8cDNA文库2.9SNP技术及应用2.10基因打靶琼脂糖凝胶电泳1、原理：2、用途：3、技术要点琼脂糖凝胶电泳的原理1.DNA电泳迁移：电荷效应＋分子筛效益（1）DNA带负电，电场中，向正极移动；（2）决定移动速度三因素：DNA大小，电荷

2、数，构型；(3)线性DNA分子移动速度与其分子质量的对数成反比；（分子量越大，跑得越慢）2、检测原理：（1）溴化乙锭（EB）可插入双链DNA分子中，在紫外光照射下，发射荧光。琼脂糖凝胶电泳用途1.DNA分子量测定（距离－>分子量）2.基因，克隆的鉴定（通过1完成）3、不同长度的基因片断的分离4、DNA浓度的测定（荧光的强度与DNA含量成正比）*也可用于蛋白的分离鉴定加标准分子量DNAMarker,测定分子量加标准浓度的DNA，测定浓度琼脂糖凝胶电泳技术要点1.不同浓度凝胶分辨DNA片段能力不一样(p33)(1)低:不利于小片段的分辨(扩散)(2)高:不利于大片段

3、的分辨(迁移不动)(3)一般选1.0%2.凝胶要用缓冲液配(TBE或TAE)3.EB强致癌，带手套操作；4.agarose(琼脂糖）－－－电泳agar(含琼脂糖和琼脂胶）－－－平板培养基SDS-PAGE电泳1、原理2、用途3、技术要点SDS-PAGE电泳原理1.SDS(带负电)和还原剂破坏蛋白的高级结构,同时SDS与蛋白定量结合,消除蛋白之间的电荷差异,使得蛋白的迁移率主要依赖分子量(分子小跑得快).2.不连续电泳:上层为浓缩胶,可将样品压缩到同一起跑线,下层为分离胶;可获得更高的分辨率.3.考马斯亮蓝进行染色.SDS-PAGE电泳用途1.蛋白分子量的测定2.蛋

4、白浓度的测定3.蛋白的鉴定(通过1来实现)SDS-PAGE技术要点1.浓缩胶一般用5%,分离胶:次高分子(10万-20万)用7%,低分子(1.4万－10万）用12％2、PAGE配制时带手套，（Acr-Bis液体有积累性神经毒，聚合后无毒)3.SDS－PAGE测定的是单体蛋白分子量；（多亚基不行）4、SDS－PAGE不适于：（1）电荷异常蛋白：组蛋白（＋电多）（2）构象异常的蛋白（3）带有较大辅基的蛋白－－糖蛋白，脂蛋白。PCR技术1、原理2、应用3、技术要点PCR技术原理循环过程(32次左右）1.解链：94℃,30s2.引物结合:？℃，30s3.延伸：72℃，？

5、Min特点1.引物两条，以2n指数扩增（前20-25次），后面扩增效率降低，30次以后，基本进入平台期。2.引物结合温度？℃一般为50-55℃，需要调整；3.延伸时间？Min需要调整，一般1kb/min.PCR技术应用1.基因检测；2.基因的制备（包括基因的修饰）PCR技术操作要点1.灵敏度高，防止污染，出现假阳性(带手套，设立阴性，阳性对照）；2.需要摸索结合温度，提高扩增的特异性。杂交技术1.Southernblot-----检测DNA2.Northernblot-----检测RNA3.Westernblot-----检测蛋白Southernblot,Nor

6、thernblot和Westernblot比较名称检测对象探针检测原理处理过程用途SouthernblotDNA标记单链核酸核酸复性中碱基配对专一性琼脂糖电泳后转膜基因检测（拷贝数）NorthernblotRNA标记单链核酸核酸复性中碱基配对专一性变性琼脂糖电泳后转膜基因表达的检测（表达量）Westernblot蛋白抗体抗原－抗体特异性结合SDS-PAGE后转膜基因表达产物――蛋白的检测ELISA原理和用途类似于Westernblot,但在酶标板中操作，无需SDS-PAGE转膜，操作简单，可批量检测，并可半定量测定。SouthernblotNorthernblo

7、tWesternblot双脱氧法测序(Dudeoxysequenceanalyses)双脱氧法又称末端终止法，用于单链测序1.原理：Atkinson发现用DNApol合成DNA时如在反应物中加入一定量的2`,3`ddTTP时，因ddT的3`碳原子不含－OH,故DNA不能延伸。1982年Sanger利用此原理建立了双脱氧测序法。原理和加减法相似，但不再是加一种dNTP或减一种dNTP,而是加入某一种双脱氧核苷，来终止聚合反应。用此法测得G4含5577bp.2.1细菌转化通常情况下，外源基因无法进入细菌细胞内；当用电击法，或CaCl2，或RuCl等方法处理后，细胞膜

8、的通透性发生变化，成为能