分子生物学研究法（下）

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1、基因功能研究技术分子生物学研究法下1分子生物学研究方法（下）基因功能研究技术26·1基因表达研究技术基因表达系列分析技术（serialanalysisofgeneexpression，SAGE）是一种以测序为基础定量分析全基因组表达模式技术，能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息。6·1.1基因表达系列分析技术3原理：根据理论上任何长度超过9～10(49=262144)个碱基的核苷酸片段可代表一种转录产物的特异序列（转录本），因此，选择特定的限制性内切酶分离转录产物中这些代表基因特异性9～10个碱基的核苷酸序列并制成标签，将这些序

2、列标签连接、克隆和测序，根据其占总标签数的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。4SAGE程序:分离提取mRNA逆转录合成cDNA4bp碱基的锚定酶（AE）以与生物素相连的寡聚dT为引物分离与抗生物素及微磁球相连的3′端cDNA提取总RNA53′端cDNA分两份分别与连接子1和连接子2连接标签酶（TE）切割DNA聚合酶(Klenow)补平含有9－14个碱基的标签标签1标签266·1·2RNA选择性剪切RNA选择性剪接是指用不同的剪切方式（选择不同的剪切位点组合）从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。选择剪接使一个基因翻译为多

3、种蛋白质序列，是基因表达多样性的重要表现形式。9类型平衡剪切5′选择性剪切3′选择性剪切相互排斥剪切外显子遗漏5′ss3′ss5′ss5′ss5′ss5′ss3′ss3′ss3′ss3′ss5′ss3′ss10检测方法RT-PCRcDNA以两端特异序列设计引物观察PCR产物大小是否存在差异存在差异有选择性剪切提取不同组织的总RNA分离mRNAPCR不存在差异无选择性剪切116·1·3原位杂交技术原位杂交技术（insituhybridization，ISH）是用标记的核苷酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核

4、酸进行定位和相对定量研究的一种手段。分RNA原位杂交和染色体原位杂交两大类。12FISH的是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。荧光原位杂交技术FISH（fluorescenceinsituhybridization）13与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点目前这项技术已经广泛应用于

5、动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。14荧光原位杂交显示的着丝粒卫星DNA荧光原位杂交显示的端粒荧光素标记探针DNA染色体DNA检测荧光素来确定与探针DNA序列杂交的互补序列在染色体或DNA上的位置156.1.4定点突变技术定点突变（site－directedmutagenesis）是重组DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个（些）氨基酸残疾对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控

6、元件特征序列、维修表达载体、引入新的酶切位点等。16体外定点突变的具体方法有三种：（1）寡聚核苷酸介导的定点突变；（2）双引物法定点突变（重叠延伸技术）；（3）大引物诱变法。以上三种方法虽不同，但原理都一致。171、寡聚核苷酸介导的DNA突变技术已知序列的环状DNA人工合成一段引物变性模板定点突变细菌转化延伸诱变寡核苷酸引物DNA聚合酶筛选引入突变的环状DNA182、重叠延伸技术正向诱变引物FM反向引物R2正向引物F2反向诱变引物RM已知序列DNA模板在重叠区发生退火PCR3使用引物F2和R2扩增PCR4全长突变DNA片段形成全长双链突变D

7、NA反向互补产物产物21PCR193、大引物诱变法PCR1产物正向诱变引物（M）反向引物（R1）双链大引物退火和野生型基因复性PCR2正向引物（F2）退火温度PCR2>PCR1已知序列DNA模板全长突变DNA片段20（1）易错PCR技术为代表的无性进化无性突变是向单一酶分子基因内随机引入突变，制造突变酶库以便筛选易错PCR在采用Taq酶进行PCR扩增目的基因时，通过调整反应条件，例如提高酶离子浓度，改变dNTP的浓度等，改变Taq酶的突变频率非定点突变21（2）DNA改组技术为代表的有性进化DNA改组又称为有性PCR，基本操作过程是从正突变

8、基因库中分离出来的DNA片段用酶随机切割，得到的随机片段经过不加引物的多次PCR循环，循环过程中随机片段互为模板和引物进行扩增，直到获得全长的基因，这导致来自不同基因的片段重组。