分子生物学分子生物学研究方法下 课件

分子生物学分子生物学研究方法下 课件

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时间:2018-08-03

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1、第六章分子生物学研究法(下)——基因功能研究技术6.1基因表达研究技术6.2基因敲除技术6.3蛋白质及RNA相互作用技术6.4基因芯片及数据分析6.5利用酵母鉴定靶基因功能6.6其他分子生物学技术6.1基因表达研究技术6.1.1基因表达系列分析技术6.1.2RNA的选择性剪切技术6.1.3原位杂交技术6.1.4基因定点突变技术6.1基因表达研究技术SAGE是以DNA序列测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术。任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物,因此,根据某个序列

2、占总标签数的比例可分析所对应基因的表达频率。6.1.1基因表达系列分析技术(SAGE)常规SAGE方法(shortSAGE)6.1基因表达研究技术常规SAGE方法(shortSAGE)基本流程6.1基因表达研究技术—标签来自转录物3’端一段21bp的序列,可以进行快速分析并与基因组序列数据相匹配。—原理与ShortSAGE方法类似,只是用了不同的IIS类标签酶(MmeI),并将程序做了相应修改。LongSAGE技术:6.1基因表达研究技术RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生

3、不同的mRNA剪接异构体的过程。类型:平衡剪切、5’选择性剪切、3’选择性剪切、外显子遗漏型剪切及相互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某个基因是否存在选择性剪切。6.1.2RNA的选择性剪接技术6.1基因表达研究技术选择性剪切的不同类型RT-PCR检测5个拟南芥转录调控因子基因的选择性剪切6.1基因表达研究技术果蝇Dscam基因可以通过可变剪接产生38000多种可能的mRNA异构体6.1基因表达研究技术原位杂交(ISH)是用标记的核酸探针,经放射自显影或非放射检测体系,在组织、细胞、间期核及染色

4、体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。分为RNA和染色体原位杂交两大类。RNA原位杂交用放射性或非放射性(如地高辛、生物素等)标记的特异性探针与被固定的组织切片反应,若细胞中存在与探针互补的mRNA分子,两者杂交产生双链RNA,可通过放射性标记或经酶促免疫显色,对该基因的表达产物做出定性定量分析。6.1.3原位杂交技术6.1基因表达研究技术mRNA的互补链,杂交信号集中于纤维细胞中。负对照,mRNA的同义链,无杂交信号正对照,UBQ10杂交信号遍布于整个胚珠6.1基因表达研究技术荧光原位杂交

5、(FISH)首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记,然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合,再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。6.1基因表达研究技术通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列,用于研究某个(些)氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响,也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。目前,主要采用两种PCR方法,重叠延伸技术和大引物诱变法,在基因序列中进行定点突变。6.1.4基因定点突

6、变技术6.1基因表达研究技术寡核苷酸介导的DNA突变技术6.1基因表达研究技术重叠延伸介导的定点诱变6.1基因表达研究技术大引物诱变法示意图6.1基因表达研究技术6.2.基因敲除技术(geneknock-out)通过一定的途径使特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理,用同源片段替代靶基因片段,进行精确的定位修饰和基因改造,同染色体一起稳定遗传。6.2.1基本原理6.2.2高等动物基因敲出技术6.2.3植物基因敲出技术6.2基因敲除技术经典遗传学(Forward

7、genetics)是从一个突变体的表型出发,研究其基因型,进而找出该基因的编码序列。现代遗传学(Reversegenetics,反向遗传学)首先从基因序列出发,推测其表现型,进而推导出该基因的功能。基因敲除(geneknock-out)又称基因打靶,通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组,进行精确的定点修饰和基因改造,具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。6.2.1基本原理6.2基因敲除技术基因敲除分两种:完全基因敲除、条件型基因敲除(又称不完全基因敲除)。完全基因敲除是指

8、通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。噬菌体Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统,尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。6.2基因敲除技术用取代型(a)或插入型(b)载体进行完全基因敲除实验6.2基因敲除技术正负筛选法(PNS法)筛选已发生同源重组的细胞6.2基因敲除技术真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体,用电

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