分子生物学研究方法上(I)

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1、第五章分子生物学研究方法（上）——DNA、RNA、蛋白质操作技术从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是现代分子生物学研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。5.1重组DNA技术回顾5.2DNA基本操作技术5.3RNA基本操作技术5.4SNP的理论与应用5.5基因克隆技术5.6蛋白质组与蛋白质组学技术本章主要内容：5.1重组DNA技术回顾

2、5.1.1重组DNA技术诞生的理论基础5.1.2关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基5.1.3重组DNA技术的概念5.1.4重组DNA技术的基本步骤5.1.5重组DNA技术的意义5.1.6重组DNA实验中常见的主要工具酶5.1.7目的基因的来源5.1.8重组实验中的基因载体5.1重组DNA技术回顾40年代明确了遗传的物质基础是DNA50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制，解决了基因的自我复制和遗传信息传递问题。50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的

3、流向和表达问题。5.1.1重组DNA技术诞生的理论基础5.1.2关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基1、DNA分子的切割与连接技术限制性核酸内切酶(1972)和连接酶(1967)的陆续发现，才使分子生物学家有了进行DNA操作的基本工具。2、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立1970年M.Mandel和A.Hige发现，大肠杆菌的细胞经过氯化钙适当处理之后，便能吸收λ噬菌体的DNA。1972年美国斯坦福大学S.Cohen报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立，对重组DNA技术的创立具有特

4、别重要的意义。3、Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链反应5.1重组DNA技术回顾Southern印迹结果重组DNA技术(recombinantDNAtechnique):是按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组,再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA的大量拷贝。基因克隆(genecloning)分子克隆(molecularcloning)5.1.3重组DNA技术的概念5.1重组DNA技术回顾克隆——来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合5.1.4重组DNA技术的基本步骤1、四大要素①外

5、源基因（目的基因）②载体③工具酶④受体细胞5.1重组DNA技术回顾2、重组DNA技术的基本步骤①目的基因的获得与载体的制备②目的基因与载体DNA的连接③重组DNA分子导入受体细胞④重组体的筛选与重组DNA的鉴定⑤克隆基因的表达及表达产物的检测与分离纯化5.1重组DNA技术回顾重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交5.1重组DNA技术回顾重组DNA

6、技术操作过程可形象归纳为：分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体细胞筛筛选重组体5.1.5重组DNA技术的意义重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟重组DNA技术缩短了进化时间重组DNA技术使人能对生物进行定向改造体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物学的研究领域，这对医学上各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意义。5.1重组DNA技术回顾酶类功能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶

7、Ⅰ按5‘到3’方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5’-OH末端末端转移酶在双链核酸的3‘末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶Ⅲ从DNA链的3’末端逐个切除单核苷酸λ噬菌体DNA外切酶从DNA链的5’末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5’或3’末端的磷酸基团5.1.6重组DNA实验中常见的主要工具酶5.1重组DNA技术回顾限制性核酸内切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ限制性

8、核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶.1972年发现第一个内切核酸酶EcoRⅠ。分类:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）5.1、重组DNA技术回顾第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第