大学分子生物学经典课件第七章 分子生物学研究方法(上)

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1、第七章分子生物学研究方法第一节重组DNA技术回顾第二节DNA基本操作技术第三节RNA基本操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术7/17/20211第一节重组DNA技术回顾一、重组DNA技术发展史上的重大事件第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者：即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；7/17/20212第二，50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相

2、继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。7/17/20213但是：当时由于缺乏有效的分离和富集单一DNA分子的技术，科学家无法对这类物质进行直接的生化分析。随着DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生与发展。7/17/20214重组DNA技术（recombination）：是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的

3、过程。7/17/20215工具酶：限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）DNA连接酶（DNAligase）工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。7/17/20216（一）限制性内切酶(RE)1、概念：一类能识别和切割双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶。2、分类：I型、II型、Ⅲ型7/17/20217类型II：识别位点和酶切位点一致，具特异性。单体酶，性质稳定，Mg2+为辅助因子。目前已分离了数百种。类型I：识别的DNA序列长约十几个bp；酶切位点在距识

4、别位点1kb左右处随机切割，非特异性；复合酶，无使用价值。类型Ⅲ：酶切位点在识别位点下游24-26bp处，非特异性。单体酶，如HgaI:GACGCnnnnn7/17/202183、II型限制性内切酶的基本特性5’…GCTGAATTCGAG…3’3’…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点(1)识别dsDNA分子中4～8bp的特定序列(2)大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧(3)识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构7/17/20219EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…

5、G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’POH7/17/202110（二）DNA连接酶(ligase)将两段DNA片段连接起来的酶称为DNA连接酶。1、E.coliDN

6、Aligase:连接粘端,催化需要NAD+参与2、T4DNAligase:连接粘端和平端，催化需要ATP参与都不连接单链7/17/202111DNA连接酶的基本性质修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键nickOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’POHDNA连接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’7/17/202112二、基因克隆的载体克隆用载体：

7、是指具备自我复制能力的DNA分子。常见的分子克隆载体有：病毒、噬菌体、质粒。克隆用载体的选择具备复制原点，能够自我复制具备适合的酶切位点，且不在原点具有筛选指标对抗菌素的抗性基因产物的显色反应7/17/202113载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件7/17/202114三、基因克隆的操作1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段；2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自

8、我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子；7/17/2021153、感受态细胞的制备—氯化钙法第一次摇菌第二次摇菌离心收集细菌0.1MCaCl2重悬细胞,冰浴30min离心、重悬重复一次7/17/2021164、转化（transformation）感受态细胞与连接产物轻轻混匀,冰浴30min，42℃水浴热激60–90s，快速冰浴2min加液体LB振荡培养，使细胞复苏。7/17/2021175、筛选（screeni