分子生物学第五章分子生物学研究法

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1、第五章分子生物学研究方法1、重组DNA技术发展史上的重大事件2、DNA操作技术3、RNA基本操作技术4、核苷酸序列分析分子生物学从20世纪中叶开始高速发展，最主要的原因之一是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作：DNA的切割和连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析、基因的人工合成、定点突变和PCR扩增。这是分子生物学研究的核心技术。基因工程：在体外将核酸分子插入载体分子中，使之进入寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物

2、细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其他技术的根本特征。本章将在回顾重组DNA技术史上主要事件基础上，讨论DNA操作技术、基因克隆的常用载体系统以及基因的分离与鉴定等3个环节。5·1重组DNA技术史上的重大事件半个世纪以来，分子生物学研究主要取得了3大成就:第一解决了遗传的物质基础问题－－基因的分子载体是DNA;5·1重组DNA技术史上的重大事件第二DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题;5·1重组DNA技术史上的重大事件第三“中心法则”和操纵子学说，成功地破译

3、了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。这些酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。限制性核酸内切酶能从特定碱基序列位点切开DNA。1972，Boyer实验室发现核酸内切酶EcoRI能特异识别GAAUC序列，将DNA在这个位点切开产生具有粘性末端的小片段。EcoRl酶切产生的任何不同来源的DNA片段能通过粘性末端之间

4、碱基互补作用而彼此“粘合”起来。目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电冰技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。5·2DNA基本操作技术5·2·1核酸凝胶电泳技术1.基本原理生物大分子在一定pH条件下，通常会带电荷。将其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。5·2·1核酸的凝胶电泳1.基本原理分子在电场作用下的迁移速度与电场强度和电泳分子所带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。5·

5、2·1核酸的凝胶电泳1.基本原理根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子(磷酸基团)，在电场中会向正电极的方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度，取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。2.琼脂糖凝胶电泳化学修饰的低熔点琼脂糖(线性多糖聚合物)，在较低温度下便会熔化，冷却凝固便形成良好的电泳介质。常用于DNA片段的电泳制备。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围

6、为0.2-50kb之间;而聚丙烯酰胺凝胶(SDS)分辨范围为1-1000bp之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。如20%的SDS凝胶可分离1-6bp的DNA小片段，而分离1000bp的DNA片段则用3%的SDS凝胶。再如2%琼脂糖凝胶可分离300bp的双链DNA分子，而分离大片段DNA就要用低浓度(0.3%-1.0%)的琼脂糖凝胶。脉冲电场凝胶电泳（PFGE)可分离50Kb的DNA小片段溴化乙锭(EB)能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间(图5-4)，

7、并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光,荧光强度与DNA片段的数量成正比(可检测到0.05μg的DNA)。把EB直接加到凝胶介质中或电泳后染色。细菌转化：细菌菌株由于捕获了外源DNA导致性状特征发生遗传改变的生命过程。大肠杆菌是分子生物学家常用的实验材料，也是基因工程重要的实验菌株。5.2.2细菌转化与目标DNA分子的增殖5.2.2细菌转化与目标DNA分子的增殖供体菌株、受体菌株、感受态细胞、阳性克隆细菌转化方法CaCl2法、电击法（电脉冲）、体外包装法（噬菌体）大肠杆菌低温(0℃)预处理的低渗氯化

8、钙溶液中，外源DNA粘附在细胞表面，立即将其转到42℃下做短暂的热刺激，外源DNA被细胞所吸收（感受态）。5.2.2细菌转化与目标DNA分子的增殖5·2·3基因扩增聚合酶链式反应即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。PCR技术的原理先将双链DNA分子加热分离成单链，单链DNA模板＋４种dNTP→DNA聚合酶→新生的DNA互补链。