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时间:2019-07-01
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1、第五章分子生物学研究法(上)DNA、RNA及蛋白质操作技术分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展,其中最主要的原因之一是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等,是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子,构成遗传物质的新组合,使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增殖能力和表达。因此,基因工程技术其实是核酸操作技术的一部分,只不
2、过我们在这里强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上,这种跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力,是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。本章将在回顾重组DNA技术发展史的基础上,讨论DNA操作技术、基因克隆、表达分析技术及蛋白质组学、单核苷酸多态性分析等现代生物学领域里最广泛应用的实验技术和方法。5.1重组DNA技术史话近半个多世纪来,分子生物学研究取得了前所未有的进步,概括地说,主要有三大成就:第一,在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子
3、载体是DNA而不是蛋白质,解决了遗传的物质基础问题;第二,50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题;第三,50年代末至60年代,相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码,阐明了遗传信息的流动与表达机制。但是,由于缺乏有效的分离和富集单一DNA分子的技术,科学家无法对这类物质进行直接的生化分析。事实上,DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生与发展。因为重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶(Restrictionend
4、onuclease,RE)和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接,所以,科学家认为,这些工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件(表5-1238)。限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。1972年,Boyer实验室发现有一种核酸内切酶EcoRI能特异性识别GAATTC序列,将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。他们还发现,能够把EcoRI酶切产生的任何不同来源的DNA片段通过粘性末端之间的碱基互补作用而彼此“粘合”起来。此后,大量类似于EcoRI但具有独
5、特识别序列的核酸内切酶被陆续发现(图5-1)。到目前为止,科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段,再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开,供下一步研究。表5-1重组DNA技术史上的主要事件年份事件1869F.Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。1957A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。1959-1960Uchoa发现RNA聚合酶和信使RNA,并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破译了第一个遗传密码;Jacob和Mono
6、d提出了调节基因表达的操纵子模型。1964Yanofsky和Brenner等人证明,多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。1965Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定;科学家证明细菌的抗药性通常由“质粒”DNA所决定。1966Nirenberg,Uchoa,Khorana,Crick等人破译了全部遗传密码。1967第一次发现DNA连接酶1970Smith,Wilcox和Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶,Temin和Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。1972-1973Bo
7、yer,Berg等人发展了DNA重组技术,于72年获得第一个重组DNA分子,73年完成第一例细菌基因克隆。1975-1977Sanger与Maxam和Gilbert等人发明了DNA238序列测定技术,1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。1978首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以被专利化。1981Palmiter和Brinster获得转基因小鼠,Spradling和Rubin得到转基因果蝇。1982美、英批准使用第一例基因工程药物——
8、胰岛素,Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。1983获得第一例转基因植物。1984斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。1986GMO首次在环境中释放。1988Watson出任“人类基因组计划”首席科学家。1989DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠—“On
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