5-分子生物学研究方法

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1、第五章分子生物学研究方法5.1重组DNA技术发展史5.2DNA操作技术5.3基因克隆技术5.4基因表达研究技术5.5蛋白质组学及研究技术5.1重组DNA技术发展史40年代明确了遗传的物质基础是DNA50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制，解决了基因的自我复制和遗传信息传递问题。50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。5.1.1重组DNA技术诞生的理论基础5.1.2关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基1、DNA分子的切割与连接技术

2、限制性核酸内切酶和连接酶的陆续发现，才使分子生物学家有了进行DNA操作的基本工具。2、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立1970年M.Mandel和A.Hige发现，大肠杆菌的细胞经过氯化钙适当处理之后，便能吸收λ噬菌体的DNA。1972年美国斯坦福大学S.Cohen报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立，对重组DNA技术的创立具有特别重要的意义。3、Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链反应5.1重组DNA技术发展史重组DNA技术(recombinantDNAtechni

3、que):是按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组,再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA的大量拷贝。基因克隆(genecloning)分子克隆(molecularcloning)5.1.3重组DNA技术的概念5.1重组DNA技术发展史5.1.4重组DNA技术的基本步骤1、四大要素①外源基因②载体③工具酶④受体细胞5.1重组DNA技术发展史2、重组DNA技术的基本步骤①目的基因的获得与载体的制备②目的基因与载体DNA的连接③重组DNA分子导入受体细胞④重组体的筛选与重组DNA的鉴定⑤克隆

4、基因的表达及表达产物的检测与分离纯化5.1重组DNA技术发展史重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交5.1重组DNA技术发展史5.1.5重组DNA技术的意义重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟重组DNA技术缩短了进化时间重组DNA技术使人能对生物进行定向改造体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物学的研究领域，这

5、对医学上各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意义。5.1重组DNA技术发展史酶类功能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶Ⅰ按5‘到3’方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5’-OH末端末端转移酶在双链核酸的3‘末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶Ⅲ从DNA链的3’末端逐个切除单核苷酸λ噬菌体DNA外切酶从DNA链的5’末端

6、逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5’或3’末端的磷酸基团5.1.6重组DNA实验中常见的主要工具酶5.1重组DNA技术发展史限制性核酸内切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶分类:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）5.1、重组DNA技术发展史第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字

7、表示发现的先后次序。命名HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶5.1重组DNA技术发展史Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)即反相重复结构，是DNA分子中以某一处为轴，其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG5.1重组DNA技术发展史BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口5.1重组DNA技术发展史DNA连接酶

8、:通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片断连接成一个整体DNA分子。T4¯DNA连接酶EcoRI连接酶T7¯DNA连接酶5.1重组DNA技术发展史目的基因的来源原核细胞真核细胞：cDNA或gDNA文库人工合成及PCR扩增目的基因天然DNA（染色体DNA、病毒DNA(噬菌体DNA)、质粒DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA）5.1重组DNA技术发展史（八）重组实验中