亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与乳腺癌新辅助化疗敏感性

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1、季明华唐金海江苏省肿瘤医院乳腺科亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与乳腺癌新辅助化疗敏感性关系的研究探讨乳腺癌（breastcancer)是女性最常见的恶性肿瘤，近年来乳腺癌的发病率呈现着上升趋势。据统计目前全世界每年死于乳腺癌的病例约为41万人，约占女性全部癌症死亡病例的14%，居女性癌症死因的首位或第二位。◆研究目的和意义■目的：研究亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因C677T、A1298C多态与乳腺癌患者对新辅助化疗敏感性的关系。■意义：寻找可靠的预测指标指导个体化治疗,从而为进一步实现乳腺癌规范化综合治疗提供参考依据。◆研究对象2008年1月至2009年4月在江苏省肿瘤医院就诊的

2、61例乳腺癌患者新辅助化疗恶性证据可测量病灶术后病理◆评定标准▲化疗疗效的评定标准：参照WHO实体瘤疗效评定标准分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、无变化(SD)和进展(PD)。以CR和PR为有效▲化疗后病理反应分级标准0级：癌细胞没有变化；I级：癌细胞有轻度变化或有显著变化但＜2/3的范围II级癌细胞显著变化达2/3或以上III级癌细胞完全消失或坏死，被肉芽组织和(或)纤维组织替代把I～III级定为病理有反应！◆实验技术路线★白细胞层DNA提取步骤●MTHFRC677T多态性检测方法●结果判断●HinfI酶切MTHFR677基因DNA片段产物电泳图▲MTHFRA1298C多态性检测

3、方法▲结果判断▲MboⅡ酶切MTHFRA1298C基因DNA片段产物电泳图§试剂:4×dNTPs（宝生物工程(大连)有限公司))引物（宝生物工程(大连)有限公司)Taq酶(北京博瑞科技有限公司)限制性内切酶HinfI(宝生物工程(大连)有限公司)10×Buffer(宝生物工程(大连)有限公司)§仪器:PCR扩增仪两台(美国MJ公司，德国Biometra公司)冷冻高速离心机(0～16000r/min)(德国Eppendorf公司)可调式移液器(0～2µl,0～100µl,0～1000µl)(GILSON公司)●MTHFRC677T基因多态性检测方法PCR扩增MTHFR677基因片段(198

4、bp)MTHFR677基因型检测（HinfI酶切PCR扩增产物）结果判断●结果判断1）当为677C/C基因型时，PCR产物不能被限制性内切酶HinfI酶所识别，PCR产物则不能被消化，琼脂糖凝胶上表现为198bp片段，可清晰见到198bp一条亮带。2）当为677T/T基因型时，PCR产物被限制性内切酶HinfI酶消化后可产生175bp、23bp二个新的片段。其中23bp的片段由于太短而无法在凝胶上清楚的显示，故琼脂糖凝胶上只可清晰的见到175bp一条亮带。3）当为677C/T基因型时，可产生198bp、175bp、和23bp三个片段。其中23bp的片段由于太短而在凝胶上无法清楚显示，故琼

5、脂糖凝胶上只清晰见到198bp和175bp两条亮带。●HinfI酶切MTHFR677基因DNA片段产物电泳图lane1:Maker;lane2:C/Cgenotype;lane3:C/Tgenotype;lane4:T/Tgenotype.198bp175bp§试剂:4×dNTPs（宝生物工程(大连)有限公司))引物（宝生物工程(大连)有限公司)Taq酶(北京博瑞科技有限公司)限制性内切酶MboⅡ（宝生物工程(大连)有限公司)10×Buffer(宝生物工程(大连)有限公司)§仪器:PCR扩增仪两台(美国MJ公司，德国Biometra公司)冷冻高速离心机(0～16000r/min)(德国E

6、ppendorf公司)可调式移液器(0～2µl,0～100µl,0～1000µl)(GILSON公司)▲MTHFRA1298C基因多态性检测方法PCR扩增MTHFRA1298C基因片段(84bp)MTHFRA1298C基因型检测（MboⅡ酶切PCR扩增产物）结果判断▲结果判断1）当为1298A/A基因型时，PCR产物被限制性内切酶MboⅡ消化后可产生56bp、28bp二个新的片段。其中28bp的片段由于太短而在凝胶上无法清楚显示，故琼脂糖凝胶上只可清晰见到56bp一条亮带。2）当为1298A/C基因型时，可产生84bp、56bp、和28bp三个片段。其中28bp的片段由于太短而在凝胶上无

7、法清楚显示，故琼脂糖凝胶上只可清晰见到84bp和56bp两条亮带。▲MboⅡ酶切MTHFRA1298C基因DNA片段产物电泳图lane1:Maker;lane2:ProductofPCR；lane3:A/Agenotype;lane4:A/Cgenotype.56bp84bp●MTHFR基因型和新辅助化疗疗效的关系(表1）GenetypeC677TA1298CtypeT/TC/TC/CA/AA/CC/Cn18291444170Eff