非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染实验操作指导书(银染)V10

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1、品保部实验操作指导书编号版本页码3制定审核批准主题分析室样品检测指导书编号1.目的：规范银染检测非变性聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质或DA的测定方法与操作，特制定本规程。2.范围：本规程适用于已知蛋白表达的测定。3.责任：实验室检验人员对实施本规程负责。4.实验原理：在碱性条件下，用里醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。5.仪器与器具移液枪和枪头、脱色摇床、EP管、205ml锥形瓶、塑料盒、电泳仪、垂直电泳槽及其附件、玻璃板6.电泳试剂6.1.30%丙

2、烯酰胺溶液:丙烯酰胺：29g,N,N'-亚甲基双丙烯酰胺：1£,加去离子水定容至100ml,装于棕色瓶内，4。（2可保存两个月。6.2.过硫酸^0.lg/ml：称取过硫酸铁lg加去离子水值10mlo4°C可保存一周，-20乜可保存一个月。6.3.TEMED（四甲基乙烯基二胺）：和过硫酸铁一起作为交联反应的催化剂。易吸潮，41封闭保存。6.4.5*TBE电泳缓冲液分别称取54克Tris,27.5克硼酸，20ml0.5M/EDTA(pH=8.0)定容至1L6.5.上样LoadingBuffer分别准确称量澳酚蓝和二甲苯青各0.1克，转入50ml容量瓶中（黏附在称量纸上的少

3、量粉末可用移液器西区甲酰胺钟乳容量瓶中），再介入lmlEDTA,最后用甲酰胺定容至50mlo7.银染试剂7.1固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1L。6.20.4%硝酸银：硝酸银1克,水250mlo7.31.5%氢氧化钠：氢氧化钠15克，水1L。7.437%甲醛7.非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备6.1安装玻璃板夹心8.1.1分别取内板（10cm*7.3cm）、夕卜板（10cm*&3cm）各一块（注意勿用手接触灌胶面的玻璃），将内板置于外板夹条一侧，使内外玻板底部、两边齐平（否则需重新安装），置于玻璃夹中，将两边固定（夹子应夹在侧边条中央位置）。&1.2红色硅

4、胶条应保持清洁，以保证良好的密封性。然后将玻璃板置于制胶夹上的红色硅胶条中心，轻推夹牢即可，无需下压（按压夹子时应轻柔）。8.2制胶（6%）8.2.130%聚丙烯酰胺（29:1）8ml,5*TBE,定容至40ml（每块胶约5ml）,加过硫酸铁200ul,TEMED20ul,插入梳子。室温凝固，垂直向上轻轻拔出梳子。避免产生气泡。（若有气泡，用手轻轻弹几下玻璃板，赶尽气泡）&2.2如制备好的凝胶长时间不用，需在梳孔中加入缓冲液，用保鲜膜包好，4°C保存。9.样品处理7.1根据样品性质选择加入LoadingBuffer1:2,混匀（送检样品时，需专人专板并按要求填写上样单

5、、摆放好样品）；9.2若是DM则放入PCR仪中95°C10mino时间到后立即放在碎冰上，冷却30mino若是蛋白质则放入电饭锅中沸水煮5min0上样（参照利用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白）。150V电压下电泳。8.银染10.1.固定液固定lOmino10.2.水洗2min*3次10.3.0.4%硝酸银100ml+37%甲醛100ul,混匀，避光染色30mino10.4水洗3s*2次，动作要迅速。10.51.5%氢氧化钠100ml,加37%甲醛lml,混匀,显色至有条带出现。10.6水洗若干次，终止显色。注意事项：1.固定时间较长，则加一步水洗30min,以免胶太

6、脆而破碎。2.甲醛在使用前加入。3.最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到点清晰。4.显色过程很快，要注意把握时间，避免染色过度。5.银染液和显色液需要预冷。6.所用器皿要很洁净，不用手直接接触，以免杂蛋白污染！7.清洗用水尽量用高纯度去离子水，蒸憎水更佳，可以减少背景着色