变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验.doc

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1、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验一变性聚丙烯酰胺凝胶电泳配制溶液：1、30%Acrylamide（14.5g丙烯酰胺，0.5g双丙烯酰胺，加水溶解，定容至50ml，4℃，棕色瓶中储存）2、10%过硫酸铵（0.5gAPS，溶于5ml去离子水中，4℃可储存数个月）3、10×TBE缓冲液（10.8gTris,0.744gEDTA,5.5g硼酸，定容到100ml）4、TEMED5、20-200DNAmarker6、尿素实验步骤：1、配置10%的胶10ml：8M*10ml*60g/mol=4.8g尿素6.1mlwater3.3ml30%Acrylamide1ml10×TBE0.11mlAPS0.01ml

2、TEMED2、立即将胶倒入两块板间并插好梳子，放置，待凝固30min，时间可以适当延长。3、向电泳槽加入1×TBE，拔出梳子并用注射针筒多次洗涤点样孔，尽可能排除未聚合的丙烯酰胺。4、将DNAmarker加到点样孔中，以120V（10V/cm）进行电泳直到燃料走到靠近底部的三分之一处，大约需要60-90分钟。二银染实验银染溶液的配置：实验之前准备4℃水1、固定液（10%醋酸）：20ml冰醋酸，180mlddH2O混匀（通风厨中进行）2、染色液：将0.1gAgNO3溶解于100mlddH2O中，使用前加1.5ml37%甲醛溶液，必须储存于避光瓶中，防止接触皮肤（通风厨中进行）3、显影液：将30g

3、Na2CO3溶解于ddH2O中，冷却至4℃，使用前加1.5ml37%甲醛溶液（通风厨中进行），0.1M五水硫代硫酸钠150μl；（0.1MNa2S2O3。5H2O：将2.48gNa2S2O3。5H2O溶于100mlddH2O）。注意事项：1、染色液和显影液要现用现配；2、显影液必须在4℃使用且必须保存在4℃；3、甲醛蒸汽致癌，在通风厨内操作；4、实验室中柔和的背景光线有利于降低背景颜色；5、显色不能在透光的盒子中进行；6、溶液不能直接倒在胶面上，应使盘倾斜后将溶液倒在盘的角上，或者将每种溶液各方一盘，然后将胶从一个盘转到另一个盘；7、溶液的体积必须足够将胶全部浸没；1、显色过程中盘中须轻轻摇动

4、。实验步骤：1、固定：用刀子轻轻分开玻璃板，将带有凝胶的一块玻璃板放入盛有200ml固定液的盘子中，放在水平摇床上摇动20min或直至染料带完全消失2、洗涤：把固定液倒回大烧杯中，然后用ddH2O清洗三次，每次2min3、染色：把玻璃板放在盛有100ml染色液的盘子里，在水平摇床上摇动30min4、显影：把玻璃板在预冷ddH2O中快速过一下（不超过10s），迅速放入预冷（4℃）的显影液中，显色3-5min或直至所有的带都出现5、停止：当出现清晰的条带时，加入先前用过的500ml固定液轻轻摇动，停止显影6、用ddH2O将凝胶洗2次，每次2min7、晾干，扫描8、拍照观察