银染方法总结.doc

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1、银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有100多种。大致的原理是银离子在碱性pH环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于1ng/蛋白质点，故广泛的用在2D凝胶分析上，及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。这里介绍的是我们实验室成功运用的银染方法，主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测！如内源性GST-Pulldown、Co-IP等实验中相互作用蛋白的研究银染操作规程实验原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的

2、一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。试剂：乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛实验操作程序：固定：30min或者更长时间100ml乙醇（40%乙醇）25ml冰醋酸（10%冰醋酸）加水到250ml致敏：30min75ml乙醇（30%乙醇）17g乙酸钠或28.2g三水乙酸钠0.5g硫代硫酸钠加水到终体积250ml水洗：3x10min银染：20min0.625gAgNO3、100ul37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250ml水洗：2x1m

3、in(注意把握时间，水洗时间长显色速度慢，点的颜色偏黄色)显色：视情况而定6.25gNa2CO3、50ul37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250ml终止：10min3.65gEDTA.Na2.2H2O或者1g甘氨酸加水到终体积250ml保存：1%冰醋酸，4℃注意事项：1．固定时间较长，则加一步水洗30min，以免胶太脆而破碎。2．甲醛在使用前加入。3．最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到点清晰。4．显色过程很快，要注意把握时间，避免染色过度。5．银染液和显色液需要预冷。6．所用器皿要很洁

4、净，不用手直接接触，以免杂蛋白污染！7．清洗用水尽量用高纯度去离子水，蒸馏水更佳，可以减少背景着色。银染注意事项:1.银染主要出现在胶的表面，用薄胶（0.5-0.75mm）可以提高灵敏度。2.对于考马斯亮蓝染色的胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染。乙酸会干扰银染，因此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。如果凝胶被过度银染，可用RapidFix脱色，并用考马斯亮蓝二次染色。3.不同蛋白质对银染的反应是不一样的，尤其是碱性蛋白染色效果差。因此，不宜用银染测定不同蛋白的比例。4.染色过程中，缓慢的振荡是必要的，一般选择40-60rp

5、m.5.凝胶表面的裂纹多是由于压力、手印及表面干燥所致，所以全程操作中都应带手套。6.凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起的，所以溶液的配制应使用电导率小于1μS的去离子水。7.如果染色后有呈灰尘或烟雾状灰色或棕色的沉淀出现在凝胶表面，可能是在几步漂洗过程中洗得不够彻底，或是染色过程时温度太低。8.较深的银染背景多是丙烯酰胺中的杂质所致。9.在最初甲醇洗脱时就应该先除去甘油、尿素、甘氨酸、TritonX-100和两性电解质这些干扰性物质。10.室温操作，温度的波动往往会干扰银染的效果，恒温水浴可以解决这个问题。11.当蛋

6、白质中含有核酸或金属时，银染则不会奏效。改变固定剂和染色之前对胶进行漂洗可以改进染色效果。12.SDS凝胶中的巯基乙醇会导致在60KDa或67KDa处出现两条水平线。减少巯基乙醇的用量即可避免。13.凭借戊二醛预处理可以使各种蛋白质的染色提高40倍。14.染色使用的玻璃器皿必须非常干净，用酸浸泡可以满足要求。15.银染应尽快照相，随着时间延长，蛋白条带会变浅，而背景会加深。六我发个简单的配方，我一直用还挺好用，固定甲醇250ml、冰醋酸25ml、加双蒸水至500ml,30min,水洗2x2min，后水洗1h。敏化硫代硫酸钠

7、0.1g加双蒸水至500ml,冲洗双蒸水2x30s银反应硝酸银0.5g加双蒸水至500ml，避光孵育30min，冲洗双蒸水2次x5min显色碳酸钠10g加双蒸水至500ml，甲醛500ul，现用现加。终止观察至想要效果，1%的冰醋酸终止，七银染应该注意的事项:1.银染主要出现在胶的表面，用薄胶（0.5-0.75mm）可以提高灵敏度。2.对于考马斯亮蓝染色的胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染。乙酸会干扰银染，因此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。如果凝胶被过度银染，可用RapidFix脱色，并用考马斯亮蓝二次染色。3.不同蛋白

8、质对银染反应不一样，尤其是碱性蛋白染色效果差。因此，不宜用银染测定不同蛋白的比例。4.染色过程中，缓慢的振荡是必要的，一般选择40-60rpm.5.凝胶表面的裂纹多是由于压力、手印及表面干燥所致，所以全程操作中都应带手套。6.凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起的，所以溶液的配制应使用电导率小于1μS