dna提取和银染程序

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1、2.1.4同名异物小白菜的AFLP鉴定方法模板DNA的制备：（CTAB法）(1)取2ml离心管盖大小的三片嫩叶放入2ml灭菌的离心管，用相应大小的尖头玻璃棒研磨，使细胞壁充分破碎。(2)2%CTAB提取液在水浴锅中预热至65℃。加热前在2%CTAB提取液中加入0.4%的巯基乙醇。(3)加入750µl2%的CTAB提取液于2ml的离心管中，，充分混匀后65℃水浴1小时，期间每隔10分钟轻轻摇动一次。注意：样品的量不能太多，否则CTAB加入的量太少，细胞裂解不充分。(4)冷却至室温后，加入等体积的氯仿：异戊醇（2

2、4：1）轻轻转动摇匀。(5)保持温度在18℃以上，13000rpm离心10分钟。注意：温度太低则DNA容易和CTAB结合而沉淀。(6)用大口径枪头缓慢吸取上清液，重复步骤（4），（5）使溶液中的蛋白和多糖沉淀充分。(7)用大口径枪头缓慢吸取上清液，加入预先加好600µl异丙醇的2ml离心管。注意：吸取2/3的上清即可，不能吸取太多，防止将氯仿：异戊醇或沉淀吸入，降低DNA的纯度。(8)静置。(9)13000rpm离心10分钟，弃上清。加入1ml预冷的70%的乙醇漂洗2次，用无水乙醇漂洗1次。置于超净工作台上吹

3、干1-2小时，或用冷冻真空干燥机抽干。(10)加入100µl0.1×TE或者水溶解DNA，每100µl加入0.5µl的RNase（2mg/ml），室温放置0.5小时。(11)取2µlDNA，以λDNA为对照进行琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度，稀释为100ng/µl左右，-20℃保存。（试剂的配置见附录）AFLP分析的操作步骤(1)基因组DNA的酶切和连接基因组DNA的双酶切和接头的连接采用一步完成，其反应体系为25.0µl，包括：MseI(10U/µl)0.5µlEcoRI(12U/µl)0.5µlMseI接

4、头(50pmol/µl)1.0µlEcoRI接头(5pmol/µl)1.0µl10×ATP1.0µl10×NEB(buffer)5.0µlBSA(10mg/ml)0.25µlT4连接酶(3U/µl)0.5µl基因组DNA(100ng/µl)3.0µlddH2O12.25ul总体积25.0µl离心混匀，37℃酶切连接反应8~12小时，酶切连接处理完成后，65℃水浴处理10分钟，使酶失活，冰浴待用。接头的序列和配置见附录(7)。(2)DNA片段的预扩增将酶切连接产物稀释20倍，按如下体系预扩增：MseI接头(M+

5、0，100ng/µl)0.3µlEcoRI接头(E+0，100ng/µl)0.3µl10×PCRBuffer2.0µlMgCl2(25mmol/L)1.5µldNTP(10mmol/L)0.4µlTaqpolymerase(5U/µl)0.2µlDNA模板4.0µlddH2O11.3µl总体积20µl混合后，离心数秒，按如下PCR程序扩增:94℃5min94℃30sec56℃30sec20cycles，72℃1min72℃7min60℃30min4℃保存。预扩完成后，取5µl预扩增DNA产物和5µl上样缓冲液

6、(loadingbuffer)混合后在1.0%琼脂糖凝胶，5V/cm，1×TBE条件下检测预扩增的效果。5µl预扩增产物加入95µl0.1×TE，混合-20℃保存备用。其余预扩增DNA产物，-20℃保存备用。(3)DNA片段的选择性扩增扩增体系如下：10×PCR缓冲液2.0µlMgCI2（25mmol/L）0.8µldNTP(10mM)0.45µlTaq酶(5U/µl)0.15µlEcoRI引物(50ng/µl)1.2µlMseI引物(50ng/µl1.2µl模板DNA6µl加超纯水至20µl扩增程序为:94

7、℃2min94℃30sec65℃30sec13cycles，-0.7℃/cycle72℃1min94℃30sec56℃30sec30cycles72℃1min72℃7min变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将选择性扩增的产物20µl中加入变性上样缓冲液8µl（98%的甲酰胺，10mM的EDTA，0.25%的溴酚蓝，0.25%的二甲苯青），95℃变性5分钟，然后在冰浴中迅速冷却。在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶（配方见附录）上电泳1.5小时，电泳仪采用Bio-rab垂直电泳仪。加样量为8.5µl。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作规程

8、：(1)玻璃板的清洗玻璃板是否清洗干净直接关系到聚丙烯酰胺凝胶灌制的质量，干净的玻璃板可以明显防止灌胶时产生气泡。最好提前用洗洁精将玻璃板浸泡一天。洗干净的玻璃板晾干备用。(2)涂板清洗干净的短板用2%剥离硅胶（配方见附录）均匀的涂在短板上，将0.5%的粘合硅胶（配方见附录）均匀的涂在长板上，千万不能涂错。风干30分钟。(3)灌胶将长板和短板装配好，调至水平，检查梳子是否合适，取60ml（根据不同型