基因诊断治疗

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1、(GenediagnosisandGeneTherapy)1几乎所有的疾病均在一定程度上与基因有某种联系，基因的改变，或是疾病发生的原因，或是疾病发生的结果，或是疾病发生时的伴随现象，而这些现象的出现是有规律的。因此，可以通过检测基因的改变來反映疾病的发生和发展，疗效和预后。一、基因诊断概念二、基因诊断常用技术三、基因诊断策略四、基因诊断在临床的应用1.在遗传性疾病诊断屮的应用2.在传染性疾病诊断中的应用3.在肿瘤诊断中的应用4.在法医学上的应用五、基因诊断存在的问题和发展前景49■?1976KanYWa狭义:在基因(DNA或RNA)水平，用PCR、核酸

2、杂交、基因重组、基因芯片等各种分子生物学技术检测特定基因存在与否、结构变异和表达状态的过程，对疾病作出诊断。?核酸分了杂交技术?PCR及其衍生技术?限制性酶谱分析?限制性片段长度多态性分析?寡核昔酸探针杂交?DNA芯片技术?DNA测序技术()(1)方法:以已知顺序核酸片段作为探针，经放射性或非放射性物质标记后，再与未知的冃的核酸片段进行杂交反应，分离已杂交和未杂交的标记核酸链,通过标记信号的检测就可以对未知的目的核酸链进行定性、定量分析.(2)儿种不同形式的核酸分子杂交a.Southern迹(southemblot)杂交：用于DNA的检测，可用于基因的限

3、制性内切酶谱分析，基因突变分析等.b.Northern卬迹(Northernblot)朵交：用于RNA的检测，能对组织细胞中的总RNA或mRNA进行定性和定量分析.a.斑点朵交(dotblot):既町以检测DNA也可以检测RNA,用于特定基因及其表达的定性和定量分析.方法简单、灵散；但特界性低.b.原位杂交(insituhybridization):是细胞学技术与核酸杂交技术结合的一种核酸分析检测技术.可分为DNA原位杂交和RNA原位杂交，用于检测染色体中特定的基因位置，用于染色体疾病的诊断.分类：①玻片原位杂交:如中期的染色体和组织切片.②膜上原位杂交

4、:将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜(如硝酸纤维膜)(二)PCR技术在基因诊断屮的应用(1)等位基因特异性寡聚核昔酸(allelespecificoligonnucleotide,ASO)探针斑点杂交：PCR-ASO该方法是诊断已知点的突变：需分别合成野生型和突变型探针.在基因诊断时，只需用PCR扩增受检者

5、=

6、的DNA片段，再分别与上述探针杂交.杂交的结果有如下儿种情况：①PCR扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交一不存在这种突变；②只与突变探针杂交-突变基因为纯合子；③与正常探针和突变探针都可朵交-突变基因为朵合子；④与正常探针和突变探针都不能杂交••突

7、变基因不属于已发现的类型ASO探针杂交检测已知点突变受检者基因组DNA或含突变位点的PCR扩增产物与标记的ASO探针朵交AS01ASO2NormalHeteroHomo(2)PCR•单链构象多态性(PCRsinglestrandconformationploymorphism,PCR-SSCP)分析是一种基于单链DNA构象差别來检测点突变的方法.DNA变性形成单链，在中性条件下长度相同的单链DNA,如果碱基组成和(或)排列顺序不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性.这些分子在非变性PAGE电泳中表现出不同的迁移率.SSCP特别适于分析小于40

8、0bp的PCR产物。据认为SSCP可以区分lbp的差异PCR-SSCP分析不能确泄基因变异的内容，因此电泳后结果有差异后还需进行测序分析，确定变异性质PCR-SSCP分析原理示意⑶PCR-限制性片段长度多态性(PCRrestrictionfragmentlengthpolymorphisms,PCR-RFLP)分析基因突变导致的基因碱基组成或(和)顺序发生改变，会在基因结构屮产生新的限制性内切酶位点或使原有的位点消失.用限制酶对不同个体基因组进行消化时，其电泳条带的数目和人小就会产生改变，根据这些改变可以判断出突变是否存在.RFLPs(restricti

9、onfragmentlengthpolymorphisms)样样品1987年,H.Donis-Keller等人以RFLP为遗传标记绘制了第一张人类遗传图谱⑷PCR■变性梯度凝胶电泳分析技术双链DNA在一定浓度变性剂(尿素，甲酰胺)作用下，会变性而解链，导致DNA分子电泳迁移率变化.当在不同梯度浓度变性胶屮电泳时,DNA泳动到变性剂浓度能使DNA发生变性，DNA开始解链，从而不同的DNA片段会形成不同的迁移率条带.优点：可靠，检出单碱基突变率可达95%.缺点：富含高熔点GC区时，则难以检测出突变.18变性梯度凝胶电泳图荧光定量PCR(FQ-PCR)技术是一

10、种目前国内外应用较为广泛的定量PCR技术，是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累