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1、人高迁移率族Bl蛋白原核表达、纯化及抗体制备和初步应用作者：田爽，刘民，李欣，浦永，吴海东，汤华【摘要】目的：原核表达并纯化人高迁移率族B1蛋白（HMGB1）免疫日本大耳白兔制备其抗体。方法：构建原核表达质粒pRsetA2HMGB1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,HMGB1蛋白经异丙基BD硫代半乳糖昔（IPTG）诱导表达。融合蛋白通过Ni2+NTA树脂亲和纯化后免疫兔子制备抗体血清。以间接ELISA法检测抗体效价，Westernblot和免疫荧光染色鉴定抗体特异性。结果：成功构建原核表达质粒，表达并纯化HM
2、GB1蛋白。ELISA检测抗体效价为1:16000以±,Westernblot和免疫荧光染色确定抗体具有高度特异性。结论：HMGB1蛋白和抗体的成功制备，为下一步研究将HMGB1作为肿瘤等疾病治疗的新靶点奠定基础。【关键词】HMGB1；原核表达；抗体；癌症高迁移率族蛋白（HMG蛋白）因其相对分子质量小（Mr1材料和方法材料人淋巴细胞RNA逆转录产物，原核表达载体pRsetA2（由本实验室在pRsetA基础上改建而成，将EcoRI和Xhol位点调换），大肠杆菌XL1Blue、BL2KDE3）,肿瘤细胞系均由本实
3、验室保存。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成；TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、标准蛋白marker购自Fennents公司；各种限制性内切酶购自TaKaRa公司；DNAmarker＞日本大耳白兔、抗GADPH抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG购自赛尔生物科技有限公司；Ni2+NTASuperflow层析纯化树脂购自Qiagen；异硫氧酸（FITC）标记的驴抗兔IgG购自JacksonImmunoresearchLaboratorieso其他所用化学试剂均为分析纯以上产品。方法引物设计及
4、目的片段的扩增根据NCBI基因库中HMGB1编码区序列以及原核表达载体pRsetA2上的多克隆位点，通过Primer软件设计上下游特异性引物如下：5’GACGAATTCGCCACCATGGGCAAAGGAGATCCTAAG3'（划线处为EcoRI酶切位点）5GCTCACCTCGAGGCTTCATCATCATCATCTTCTTCTTCATC3'（划线处为XhoI酶切位点）。以人淋巴细胞RNA逆转录产物为模板进行PCR,扩增条件为：94*预变性4min,然后94£变性1min.58°C退火1min.72°C延伸1
5、min,共31个循环，最后72工延伸10minoPCR产物经琼脂糖仃0g/L）凝胶电泳后，由凝胶成像系统拍照并鉴定。原核表达质粒的构建PCR回收产物和pRsetA2空载体以EcoRI和XhoI双酶切，371水浴过夜后，进行琼脂糖(10g/L)凝胶电泳并回收，然后在T4DNA连接酶作用下室温连接4h,转化XL1Blue,通过氨节青霉素(Amp+)抗性筛选得到重组子。挑取阳性克隆小提质粒DNA并双酶切鉴定。pRsetA26hisHMGB1融合蛋白的诱导表达鉴定正确的质粒转化BL21(DE3),涂布于Amp+抗性的
6、LB平板37X：过夜培养。然后挑取单克隆于2mLLB中，37°C230r/min振荡培养过夜。次日按1：20比例接种培养物到10mL新鲜的LB中，37°C230r/min振荡培养约2h,直到A600二。取1mL作为诱导前对照，其余的加入IPTG至终浓度为1mmol/L,3(TC继续振荡培养4h。然后5000g离心5min,去上清收集菌体，加入BufferB(100mmol/LNaH2P04,10mmol/LTris•Cl,8mol/Lurea,)重悬菌体后超声裂解,10000g离心10min留取上清。取部分上
7、清加入上样缓冲液(含有100mL/LB疏基乙醇)水浴煮沸5min,冰置待上样,进行SDSPAGE电泳，考马斯亮蓝染色分析。融合蛋白的纯化将表达融合蛋白的菌液转接到300mLLB中扩大培养，并按上述条件诱导表达和裂解菌体，然后离心将上清液加到Ni2+NTA树脂中，4£旋转混匀30min,加入BufferC(100mmol/LNaH2P04,10mmol/LTris•Cl,8mol/Lurea,)洗涤柱床去除杂蛋白,再加入BufferD(100mmol/LNaH2P04,10mmol/LTris•Cl,8mol/
8、Lurea,)洗脱目的蛋白，最后洗脱液经磷酸盐缓冲液(PBS)透析后-2CTC保存。其中每一步流下的液体取部分上样进行SDSPAGE分析。免疫兔子制备抗体血清取200Pg蛋白与弗氏完全佐剂按1：1比例混合后皮下注射初次免疫兔子，以后每间隔2周，取200ug蛋白与弗氏不完全佐剂按1:1比例混合加强免疫2次，1周后兔耳缘静脉取血检测抗体效价并加强免疫1次，如达到所需效价值7d后取全血。间接ELISA法检
