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1、人高迁移率族Bl蛋白原核表达、纯化及抗体制备和初步应用作者：山爽，刘民，李欣，浦永，吴海东，汤华【摘要】目的：原核表达并纯化人高迁移率族B1蛋A(HMGB1)免疫日木人耳白兔制备其抗体。方法：构建原核表达质粒pRsetA2HMGB1,转化大肠杆菌BL21(DE3),HMGB1蛋口经异丙基BD硫代半乳糖昔(IPTG)诱导表达。融合蛋白通过Ni2+NTA树脂亲和纯化后免疫兔了制备抗体血清。以间接ELTSA法检测抗体效价‘Westernblot和免疫荧光染色鉴定抗体特异性。结果：成功构建原核表达质粒，表达并纯化HMGB1蛋口。EL1SA
2、检测抗体效价为1:16000以上,Westernblot和免疫荧光染色确定抗体具有高度特异性。结论：HMGB1蛋白和抗体的成功制备，为下一步研究将HMGB1作为肿瘤等疾病治疗的新靶点奠定基础。【关键词】HMGB1;原核表达;抗体；癌症高迁移率族蛋白(HMG蛋白)因其和对分了质暈小(Mr1材料和方法1.1材料人淋巴细胞RNA逆转录产物，原核表达载体pRsetA2(由本实验室在pRsetA基础上改建而成，将EcoRI和Xho1位点调换)，大肠杆菌XL1Blue.BL2KDE3),肿瘤细胞系均由木实验室保存。引物由北京奥科生物技术冇限责
3、任公司合成;TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、标准蛋ftmarker购白Ferments公司；各种限制性内切购自TaKaRa公司；DNAmarker>口本大耳白兔、抗GADPH抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG购口赛尔生物科技有限公司；Ni2+NTASuperflow层析纯化树脂购口Qiagen;异硫氤酸(FITC)标记的驴抗兔IgG购自JacksonImmunoresearchLaboratories0其他所用化学试剂均为分析纯以上产品。1.2方法1.2.1引物设计及目的片段的扩增根据NCBI基因库中HMGB1
4、编码区序列以及原核表达载体pRsetA2上的多克隆位点，通过PrimerPremiers.0软件设计上下游特异性引物如下：5’GACGAATTCGCCACCATGGGCAAAGGAGATCCTAAG3’(划线处为EcoRI脚切位点)5’GCTCACCTCGAGGCTTCATCATCATCATCTTCTTCTTCATC3’伐U线处为XhoT酚切位点)。以人淋巴细胞RNA逆转录产物为模板进行PCR,扩增条件为：94°C预变性4min,然后94°C变性1min、58°C退火1min、72°C延伸1min,共31个循环，最后72°C延伸1
5、0min。PCR产物经琼脂糖(10g/L)凝胶电泳后，由凝胶成像系统拍照并鉴定。1.2.2原核表达质粒的构建PCR回收产物和pRsetA2空载体以EcoRI和XhoT双酶切，37°C水浴过夜后，进行琼脂糖(10g/L)凝胶电泳并回收，然后在T4DNA连接他作用下室温连接4h,转化E.coliXL1Blue,通过氨节青霉素(Amp+)抗性筛选得到重组子。挑取阳性克隆小提质粒DNA并双酶切鉴定。1.2.3pRsetA26hisHMGB1融合蛋白的诱导表达鉴定正确的质粒转化E.coliBL2KDE3),涂布于Amp+抗性的LB平板37°
6、C过夜培养。然后挑取单克隆于2mLLB中，37°C230r/min振荡培养过夜。次LI按1：20比例接种培养物到10mL新鲜的LB屮，37°C230r/min振荡培养约2h,直到A600二0.5-0.7。取1ml.作为诱导前对照，其余的加入TPTG至终浓度为1mmol/L,30°C继续振荡培养4h。然后5000g离心5min,去上清收集菌体，加入BufferB(100mmol/LNaH2P04,10mmol/LTris•Cl,8mol/Lurea,pH&0)重悬菌体后超声裂解，10000g离心10min留取上清。取部分上清加入上样
7、缓冲液(含有100mL/LB疏基乙醇)水浴煮沸5min,冰置待上样，进行SDSPAGE电泳，考马斯亮蓝染色分析。1.2.4融合蛋白的纯化将表达融合蛋口的菌液转接到300mLLB中扩人培养，并按上述条件诱导表达和裂解菌体，然后离心将上清液加到Ni2+NTA树脂中，4°C旋转混匀30min,加入BufferC(100mmoI/LNaH2PO4,10mmol/LTris・Cl,8mol/Lurea,pH6.3)洗涤柱床去除杂蛋白，再加入BufferD(100mmol/LNaH2P04,10mmol/LTris•Cl,8mol/Lurea
8、,pH4.5)洗脱目的蛋白，最后洗脱液经磷酸盐缓冲液(PBS)透析后-20°C保存。其中每一步流下的液体取部分上样进行SDSPAGE分析。1.2.5免疫兔子制备抗体血清取200ng蛋白与死氏完全佐剂按1：1比例混合后皮下注射初次免疫兔子，以后每间隔
