人高迁移率族B1蛋白原核表达、纯化及抗体制备及初步应用

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1、人高迁移率族Bl蛋白原核表达、纯化及抗体制备及初步应用作者：田爽，刘民，李欣，浦永，吴海东，汤华【摘要】目的：原核表达并纯化人髙迁移率族B1蛋白(HMGB1)免疫日本大耳白兔制备其抗体。方法：构建原核表达质粒pRsetA2HMGB1,转化大肠杆菌BL21(DE3),HMGB1蛋白经异丙基BD硫代半乳糖昔(IPTG)诱导表达。融合蛋白通过Ni2+NTA树脂亲和纯化后免疫兔子制备抗体血清。以间接ELISA法检测抗体效价，Westernblot和免疫荧光染色鉴定抗体特异性。结果：成功构建原核表达质粒，表达并纯化HMGB1蛋白。ELISA检测抗体效价为1:1

2、6000以上，Westernblot和免疫荧光染色确定抗体具有高度特异性。结论：HMGB1蛋白和抗体的成功制备，为下一步研究将HMGB1作为肿瘤等疾病治疗的新靶点奠定基础。【关键词】HMGB1；原核表达；抗体；癌症高迁移率族蛋白(HMG蛋白)因其相对分子质量小(Mr<；30000),在聚丙烯酰胺凝胶电泳中快速迁移而被命名。人高迁移率族B1蛋白(highmob订itygroupbox1,HMGB1)基因位于染色体13ql2,它包括3个不同的功能区,N末端(A区和B区)富含带正电荷的赖氨酸，而C末端(C区)富含带负电荷的天冬氨酸和谷氨酸[l]oHMG

3、B1蛋白在胞内外都有分布，根据其分布不同而发挥不同的生物学效应。细胞核HMGB1参与构建核小体，维持其稳定性，同时在DNA重组、复制、修复和基因转录中起重要的辅助作用。细胞外HMGB1具有细胞因子特性，它与细胞分化、迁移、增殖、凋亡以及炎症反应的诱导等密切相关[2],而且在人类病理状态下如Alzheimer"s病、败血症、局部缺血再灌注损伤、关节炎和癌症中，都伴随着HMGB1蛋白的失调。尤其是在癌症包括乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌等中,HMGB1蛋白过表达与肿瘤的增殖和转移有关[3]o本研究中原核表达HMGB1蛋白、纯化并制备其抗体，为深入研究将H

4、MGB1作为肿瘤等相关疾病治疗的新靶点起到了基础性作用。1材料和方法1.1材料人淋巴细胞RNA逆转录产物，原核表达载体pRsetA2(由本实验室在pRsetA基础上改建而成，将EcoRI和Xhol位点调换)，大肠杆菌XL1Blue.BL21(DE3),肿瘤细胞系均由本实验室保存。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成；TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、标准蛋白marker购自Ferments公司；各种限制性内切酶购自TaKaRa公司；DNAmarker.日本大耳白兔、抗GADPH抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG购自赛尔生物科技有限

5、公司；Ni2+NTASuperflow层析纯化树脂购自Qiagen；异硫氧酸（FITC）标记的驴抗兔IgG购自JacksonImmunoresearchLaboratories。其他所用化学试剂均为分析纯以上产品。1.2方法1.2.1引物设计及目的片段的扩增根据NCBI基因库中HMGB1编码区序列以及原核表达载体pRsetA2上的多克隆位点，通过PrimerPremier5.0软件设计上下游特异性引物如下：5'GACGAATTCGCCACCATGGGCAAAGGAGATCCTAAG3'（划线处为EcoRI酶切位点）5’GCTCACCTCGAGGCTT

6、CATCATCATCATCTTCTTCTTCATC3’（划线处为XhoI酶切位点）。以人淋巴细胞RNA逆转录产物为模板进行PCR,扩增条件为：94°C预变性4min,然后94匸变性1min.58°C退火1min.72°C延伸1min,共31个循环，最后72°C延伸10min。PCR产物经琼脂糖（10g/L）凝胶电泳后，由凝胶成像系统拍照并鉴定。1.2.2原核表达质粒的构建PCR回收产物和pRsetA2空载体以EcoRI和XhoI双酶切，371水浴过夜后，进行琼脂糖（10g/L）凝胶电泳并回收，然后在T4DNA连接酶作用下室温连接4h,转化E.coli

7、XL1Blue,通过氨节青霉素（Amp+）抗性筛选得到重组子。挑取阳性克隆小提质粒DNA并双酶切鉴定。1.2.3pRsetA26hisHMGB1融合蛋白的诱导表达鉴定正确的质粒转化E.coliBL21(DE3),涂布于Amp+抗性的LB平板37°C过夜培养。然后挑取单克隆于2mLLB中，37°C230r/min振荡培养过夜。次日按1：20比例接种培养物到10mL新鲜的LB中，37°C230r/min振荡培养约2h,直到A600=0.5-0.7o取1mL作为诱导前对照，其余的加入IPTG至终浓度为1mmol/L,3(TC继续振荡培养4h。然后5000g

8、离心5min,去上清收集菌体，加入BufferB(100mmol/LNaH2P04,10mmol/LTris