人高迁移率族b1蛋白原核表达、 纯化及抗体制备和初步应用

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1、人高迁移率族B1蛋白原核表达、纯化及抗体制备和初步应用：田爽,刘民,李欣,浦永,吴海东,汤华【摘要】目的:原核表达并纯化人高迁移率族B1蛋白(HMGB1)免疫日本大耳白兔制备其抗体。方法:构建原核表达质粒pRsetA2HMGB1,转化大肠杆菌BL21(DE3),HMGB1蛋白经异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。融合蛋白通过Ni2+NTA树脂亲和纯化后免疫兔子制备抗体血清。以间接ELISA法检测抗体效价,GB1蛋白。ELISA检测抗体效价为1∶16000以上,GB1蛋白和抗体的成功制备,为下一步研究将H

2、MGB1作为肿瘤等疾病治疗的新靶点奠定基础。【关键词】HMGB1;原核表达;抗体;癌症高迁移率族蛋白(HMG蛋白)因其相对分子质量小(Mr<30000),在聚丙烯酰胺凝胶电泳中快速迁移而被命名。人高迁移率族B1蛋白(highmobilitygroupbox1,HMGB1)基因位于染色体l3q12,它包括3个不同的功能区,N末端(A区和B区)富含带正电荷的赖氨酸,而C末端(C区)富含带负电荷的天冬氨酸和谷氨酸［1］。HMGB1蛋白在胞内外都有分布,根据其分布不同而发挥不同的生物学效应。细胞核HMGB1参与构建核小

3、体,维持其稳定性,同时在DNA重组、复制、修复和基因转录中起重要的辅助作用。细胞外HMGB1具有细胞因子特性,它与细胞分化、迁移、增殖、凋亡以及炎症反应的诱导等密切相关［2］,而且在人类病理状态下如Alzheimer’s病、败血症、局部缺血再灌注损伤、关节炎和癌症中,都伴随着HMGB1蛋白的失调。尤其是在癌症包括乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌等中,HMGB1蛋白过表达与肿瘤的增殖和转移有关［3］。本研究中原核表达HMGB1蛋白、纯化并制备其抗体,为深入研究将HMGB1作为肿瘤等相关疾病治疗的新靶点起到了基础性作用。1材料

4、和方法1.1材料人淋巴细胞RNA逆转录产物,原核表达载体pRsetA2(由本实验室在pRsetA基础上改建而成,将EcoRI和XhoI位点调换),大肠杆菌XL1Blue、BL21(DE3),肿瘤细胞系均由本实验室保存。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成;TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、标准蛋白marker购自Ferments公司;各种限制性内切酶购自TaKaRa公司;DNAmarker、日本大耳白兔、抗GADPH抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG购自赛尔生物科技有限公司;Ni2+NTASupe

5、rflomunoresearchLaboratories。其他所用化学试剂均为分析纯以上产品。1.2方法1.2.1引物设计及目的片段的扩增根据NCBI基因库中HMGB1编码区序列以及原核表达载体pRsetA2上的多克隆位点,通过PrimerPremier5.0软件设计上下游特异性引物如下:5′GACGAATTCGCCACCATGGGCAAAGGAGATCCTAAG3′(划线处为EcoRI酶切位点)5′GCTCACCTCGAGGCTTCATCATCATCATCTTCTTCTTCATC3′(划线处为XhoI酶切位点)

6、。以人淋巴细胞RNA逆转录产物为模板进行PCR,扩增条件为:94℃预变性4min,然后94℃变性1min、58℃退火1min、72℃延伸1min,共31个循环,最后72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖(10g/L)凝胶电泳后,由凝胶成像系统拍照并鉴定。1.2.2原核表达质粒的构建PCR回收产物和pRsetA2空载体以EcoRI和XhoI双酶切,37℃水浴过夜后,进行琼脂糖(10g/L)凝胶电泳并回收,然后在T4DNA连接酶作用下室温连接4h,转化E.coliXL1Blue,通过氨苄青霉素(Amp+)抗性筛选得到重组

7、子。挑取阳性克隆小提质粒DNA并双酶切鉴定。1.2.3pRsetA26hisHMGB1融合蛋白的诱导表达鉴定正确的质粒转化E.coliBL21(DE3),涂布于Amp+抗性的LB平板37℃过夜培养。然后挑取单克隆于2mLLB中,37℃230r/min振荡培养过夜。次日按1∶20比例接种培养物到10mL新鲜的LB中,37℃230r/min振荡培养约2h,直到A600=0.5-0.7。取1mL作为诱导前对照,其余的加入IPTG至终浓度为1mmol/L,30℃继续振荡培养4h。然后5000g离心5min,去上清收集菌体,加

8、入BufferB(100mmol/LNaH2PO4,10mmol/LTris·Cl,8mol/Lurea,pH8.0)重悬菌体后超声裂解,10000g离心10min留取上清。取部分上清加入上样缓冲液(含有100mL/Lβ巯基乙醇)水浴煮沸5min,冰置待上样,进行SDSPAGE电泳,考马斯亮蓝染色分析。1.2.4