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1、血小板单核细胞聚集体对全麻手术患者血小板活化状态观察重要性【摘要】目的:观察血小板单核细胞聚集体(PMA)在全麻手术前后及术后3d的变化,了解检测PMA对全麻手术前后血栓形成预测的意义。方法:流式细胞术检测112例全麻手术患者手术前、手术后及手术后3dCD62p、CD63、PMA的表达,比较其在3个不同时间的差异。结果:112例患者麻醉诱导前、手术后、术后3dCD62p的表达分别为(16.74±9・67)%、(22・76±13・89)%、(20.12±9.83)%;CD63的表达分别为(1.35土0.94)%、(2.26±1.75)
2、%、(1.54±0.81)%;PMA的表达分别为(26.86±5.05)%、(31・86±5・31)%、(77.69±5.72)%;手术后CD62p、CD63、PMA,术后3dCD62p、PMA与麻醉诱导前比较差异均有统计学意义(P1.2主要试剂与仪器鼠抗人CD62p-PE,鼠抗人CD63-FITC,同型对照(鼠IgG-FITC和鼠IgG-PE),由BD公司提供;鼠抗人CD41-FITC,鼠抗人CD61-PE,鼠抗人CD45-pc5,由美国beckmancoulter公司提供,溶血素为自配甲酸溶血素,流式细胞仪为CoulterEPI
3、CSXL(Beckmancoulter公司)。1.3标本采集分别于患者手术麻醉诱导前,手术结束及手术后3d采集标本进行CD62p、CD63和PMA检测。1.4实验方法1.4.1CD62p检测取抗凝全血500r/min,离心5min,取上层富血小板血浆,用PBS调整血小板数为100X109〜200X109/L,备用。在两支流式试管中均加入10uL鼠抗人CD41-FITC后,其中1支试管加入10UL鼠IgGPE作为同型对照管,另1支试管加入1011L鼠抗人CD62P-PE作为测试管,分别加入50uL富血小板血浆,混匀。室温避光孵育20m
4、in后,用1mLPBS缓冲液洗涤1次,离心,弃去上清。然后,加入500uLPBS缓冲液混匀后置流式细胞仪上进行检测。1.4.2CD63检测取抗凝全血500转/min,离心5min,取上层富血小板血浆,用PBS调整血小板数为100X109〜200X109/L,备用。在两支流式试管中均加入10UL鼠抗人CD61PE后,其中1支试管加入10订鼠IgGFITC作为同型对照管,另1支试管加入1011L鼠抗人CD63FITC作为测试管,分别加入50uL富血小板血浆,混匀。室温避光孵育20min后,用1mLPBS缓冲液洗涤1次,离心,弃去上清。然
5、后,加入500uLPBS缓冲液混匀后置流式细胞仪上进行检测。1.4.3PMA检测在两支流式试管中均加入5UL鼠抗人CD45pc5后,其中1支试管加入10uL鼠IgGlFITC作为同型对照管,另1支试管加入10uL鼠抗人CD41FITC作为测试管,分别加入50ULEDTA抗凝全血,混匀。室温避光孵育20min后,用甲酸溶血素溶血,PBS缓冲液洗涤1次。然后,加入500〜1000uLPBS缓冲液混匀后置流式细胞仪上进行检测。1.5流式分析(1)分别以CD41和CD61设门,圈定血小板(图1和图3),以同型对照分别设定CD62p和CD63
6、阴性界限,观察血小板上CD62p和CD63的表达百分率(图2和图4)。(2)利用CD45和SS散射光参数,可以将外周血细胞分为中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞3群(图5)。CD41抗原也称为血小板gpllb,是一种血小板上的特异性膜糖蛋白标记,如果单核细胞上显示有CD41,说明单核细胞上黏附有血小板,称为PMA,以百分比表示,以同型对照管设定PMA阴性细胞界限,可以用单参数图或散点图显示PMA的表达(图6和图7)o1.6统计学处理采用SPSS19.0软件对所得数据进行统计分析,计量资料用(x±s)表示,比较采用t检验,以P参考文献[1
7、]王振义,李家增,阮长庚•血栓与止血基础理论与临床[M].第2版.上海:上海科学技术出版社,1996:378-379.[2]MichesonAD,BarnardMR,KruegerLA,etal.Circulatingmonocyte-plateletaggregatesareamoresensitivemarkerofinvivoplateletactiviationthanplateletsurfaceP-selectin[J].Circulation,2001,104(14):1533.[1]RitterLS,StempelK
8、M,CoullBM,etal.Leukocyte-plateletaggregatesinratperipheralbloodafterischemicstrokeandreperfusion[J]・BiolRes,2005,6(2)