肾综合征出血热鼠带毒率检测需要注意的几点问题

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1、肾综合征出血热鼠带毒率检测需要注意的几点问题吕厚明金浏石（木溪市疾病预防控制中心辽宁木溪M7000）【摘要】目的随着出血热疫情的不断蔓延，分析鼠间疫情，鼠带毒率是一项重要指标。木溪市出血热疫情一肓居高不下，但鼠带毒率却一育不高，分析各种原因，2005年主要从改善实验条件、增强技术力量、缩短操作时间、强化试剂质量控制四方面入手，积极探索，反复实践，严格控制每一个小环节，检验程序标准化、科学化，从而得出科学有效数据。2005年鼠带毒率检测阳性结果比较2004年有很大提高，阳性率由2004年的1%上升为2005

2、年4.2%。现将结果汇报如下：【中图分类号】R446【文献标识码】B【文章编号】2095-1752（2013）20-0317-021材料与方法1.1样品来源：虫媒消毒科采自木溪市郊区、市区。1.2实验试剂：击血热阳性血清：采自恢复期击血热患者羊抗人IgG荧光抗体：上海中索试剂有限公司；批号：20040201患者恢复期抗体：木溪县医院提供1.3仪器设备：轮式切片机：厂家：浙江金华型号：KD1508型荧光显微镜：厂家：日木奥林巴斯型号：BH・2型1.4检测方法：《流行性出血热实验方法》19852检验程序与结果

3、2.1切片室冷冻切片一一吹干一一丙酮固定一一PBS冲洗两次一一蒸憾水一一冲洗一次一一吹干一一滴加典型病人恢复期血清和正常人对照血清一一放入有盖湿盒37°C水浴30分钟——PBS冲洗两次一一蒸镭水漂洗三次一一吹干——滴加羊抗人IgG荧光抗体（1：2或1：4内含伊文思兰1：8000）——放湿盒内——水浴37°C30分钟——PBS震洗三次——蒸谓水冲洗三次（其中震荡一次）一一吹干一一封片一一镜检一一记录并照相2.2结果阳性结果为：50%视野有荧光，荧光形状有：颗粒状、多种戒指状、飞翔海鸥形、半环形等等。阴性结果

4、为：视野均匀透明无荧光。3结果分析3.1病毒样品储存需要稳定的低温条件，深冻冰箱才能长吋间保存鼠肺样品。过去我们低温冰箱只能达到一40°C,而且温度不稳，阳性鼠肺荧光不明显。3.2操作吋间：缩短制片吋间，尽量当天采样当天切片、当天染片、当天镜下看结果；如果当天不能看结果，尽量把当天切好的片子当天染好后第二天看结果。过去由于试验人员少任务多，每次切片固定后放入冰柜，等样品都切完才集中染片观察，这样也使鼠肺抗原失活，使阳性捡出率降低。3.3患者阳性抗体血清确定后，按一定量分装后冷冻保存，以免反复冻融，降低抗体

5、滴度。使用吋，抗体血清稀释度由过去：L：20提升为410,使抗原抗体反应从分，提高检出率。3.4做好实验室质量控制荧光抗体在使用前，必须用出血热细胞抗原片子（或阳性鼠肺），作荧光抗体滴度试验，如果抗体试验镜下无荧光，说明荧光抗体试剂不能用；只有镜下视野内荧光清晰明显，然后确定滴度，方可使用。因为不仅不同厂家荧光抗体试剂实验结果不同，即使同一厂家不同批号荧光抗体试剂试验结果差距也非常大，所以在做染片子之前，荧光抗体质量控制是非常关键的。4总结综上所述，要做好鼠带毒率的实验室工作，关键是做好如下工作：4.1样

6、品低温保存，低温操作。4.2缩短操作时见，保持细胞活性。4.3分装阳性抗体血清，避免反复冻融，保持抗体滴度。4.4做好荧光抗体血清的质量控制，降低假阴性。重点做鼠带毒率检测、出血热患者急性期血清学符合工作。在鼠带毒率检测工作中，重点负责鼠肺切片工作，由于鼠肺中出血热抗原检测工作规范是根据1985年省防疫站出血热培训班学习材料作出，相关试剂的出厂滴度也非常不稳，给实际操作带来相当大的困难。本溪市的鼠带毒率工作一直不是令人满意,市疾控中心领导也非常重视，因此，在2004年新购置深冻冰箱、切片机，使鼠肺样品储存

7、、切片得到保证，在2005年春、秋两季鼠抗原检测工作中对不同试剂，不同工作滴度，做了大量对比试验，使样品的固定、染色垂新规范，尤其是荧光抗体试剂，多年来，对不同厂家、不同批号试剂我们都是按操作说明进行操作，结果一直令我们非常不满意，但一直找不出原因。2004年末，我们对试验过程的其他环节都进行认定确证无误后，人胆的对荧光抗体试剂盒提出疑问，对同一厂家不同批号试剂盒作对比试验，结果非常出乎我们的意外。对同一厂家、不同批号的试剂，试验结果完全不同，一个批号出血热抗原阳性，而另一个批号岀血热抗原阴性；针对这种情

8、况，我们又对抗原阳性试剂作对比试验，对同--样品分别做了不同抗体滴度的实验，结果又令我们非常惊讶，试剂要求试验滴度为1：16,而达到非常清晰的镜下结果却是2或者4,这无疑是一个重大突破。对反应吋间也做了对比试验，总结出最理想的反应吋间。这项工作的突破得到省疾控中心专家的好评。然而，探索工作并没有停止，镜下观察后，进行显微照相，由于从没有进行过显微照相，对放大倍数、曝光时间没有经验，我们对同一视野进行不同放大倍数、不同曝光吋间分