H9N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆表达及反应原性分析

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1、2期王方昆等：H9N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆表达及反应原性分析591H9N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆表达及反应原性分析王方昆1,2，袁秀芳2，王一成2，张存2，徐丽华2，刘思当1（1山东农业大学动物科技学院，山东泰安272018；2浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，杭州310021）摘要：【目的】对H9N2亚型猪流感病毒NS1（nonstructuralprotein1）基因进行原核表达，获得纯化表达产物，以期为检测猪流感抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增了猪流感病毒（H9N2）的NS1基因，将其克隆于表达载体pET-28a（+）上构建

2、成重组质粒pET-NS1，转化受体菌E.coliBL21-DE3感受态细胞，经酶切鉴定及序列分析，筛选出正确重组质粒转化子。【结果】经终浓度5mmol·L-1乳糖诱导，SDS－PAGE电泳结果显示，重组蛋白NS1得到大量表达，分子质量约为26kD。经Western-blotting分析，表达蛋白能与阳性血清发生特异性反应，而与阴性血清不反应；ELISA检测显示，在被检血清稀释1280倍时，阳性血清的OD650值大约是阴性血清的3倍，差异明显。【结论】重组蛋白NS1表达量高，易于纯化并且具有良好的血清学反应的特异性。关键词：猪流感病毒；NS1基因；反应原性Cloning,Proka

3、ryoticExpressionandAntigenicityAnalyzingofNS1GeneofH9N2SwineInfluenzaVirusWANGFang-kun1,2,YUANXiu-fang2,WANGYi-cheng2,ZHANGCun2,XULi-hua2,LIUSi-dang1(1CollegeofAnimalSciencesandVeterinaryMedicine,ShandongAgriculturalUniversity,Taian271018,Shandong;2InsitituteofAnimalSciencesandVeterinaryMedic

4、ine,ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou310021)Abstract:【Objective】TheNS1geneofH9N2subtypeinfluenzaAviruswasexpressedinprokaryoticexpressionsystemtoobtainrecombinantprotein.【Method】TheNS1geneofH9N2subtypeinfluenzaAviruswasamplifiedbyRT-PCR,andthenclonedintoprokaryoticexpressionvecto

5、rpET-28a(+).TherecombinantplasmidpET-NS1wasextractedafterbeingtransformedintoE.coliBL21-DE3competentcells.RestrictionenzymesdigestionandsequencesanalysisdemonstratedthattherecombinantplasmidcarryingNS1wasinsertedintocorrectopenreadingframe.【Result】TherecombinantproteinofNS1about26kDwasproduce

6、dafterinductionwith5mmol·L-1lactose.Thewestern-blottingtestshowedthattherecombinantproteinreactedwithpositiveserafrompigs,notwithnegativesera.TheOD650valuedifferencewasdistinctlythatthepositivesera1280folddilutionisabout3timesofthenegativesera.【Conclusion】Theseresultshavelaidasolidfoundationf

7、ordevelopinganeffectivediagnosticmethod.Keywords:Swineinfluenzavirus;NS1;Antigenicity2期王方昆等：H9N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆表达及反应原性分析5910引言【研究意义】猪流感是世界上最常见的猪传染病之一，传播迅速，常引起急性呼吸道疾病暴发。因为在单独感染的情况下很少引起死亡，长期以来猪流感的免疫在世界各国都没有引起足够的重视，在中国，使用猪流感病毒（swineinfluenzaviru