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时间:2019-07-11
《H9N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆表达及反应原性分析》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、2期王方昆等:H9N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆表达及反应原性分析591H9N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆表达及反应原性分析王方昆1,2,袁秀芳2,王一成2,张存2,徐丽华2,刘思当1(1山东农业大学动物科技学院,山东泰安272018;2浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,杭州310021)摘要:【目的】对H9N2亚型猪流感病毒NS1(nonstructuralprotein1)基因进行原核表达,获得纯化表达产物,以期为检测猪流感抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增了猪流感病毒(H9N2)的NS1基因,将其克隆于表达载体pET-28a(+)上构建
2、成重组质粒pET-NS1,转化受体菌E.coliBL21-DE3感受态细胞,经酶切鉴定及序列分析,筛选出正确重组质粒转化子。【结果】经终浓度5mmol·L-1乳糖诱导,SDS-PAGE电泳结果显示,重组蛋白NS1得到大量表达,分子质量约为26kD。经Western-blotting分析,表达蛋白能与阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应;ELISA检测显示,在被检血清稀释1280倍时,阳性血清的OD650值大约是阴性血清的3倍,差异明显。【结论】重组蛋白NS1表达量高,易于纯化并且具有良好的血清学反应的特异性。关键词:猪流感病毒;NS1基因;反应原性Cloning,Proka
3、ryoticExpressionandAntigenicityAnalyzingofNS1GeneofH9N2SwineInfluenzaVirusWANGFang-kun1,2,YUANXiu-fang2,WANGYi-cheng2,ZHANGCun2,XULi-hua2,LIUSi-dang1(1CollegeofAnimalSciencesandVeterinaryMedicine,ShandongAgriculturalUniversity,Taian271018,Shandong;2InsitituteofAnimalSciencesandVeterinaryMedic
4、ine,ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou310021)Abstract:【Objective】TheNS1geneofH9N2subtypeinfluenzaAviruswasexpressedinprokaryoticexpressionsystemtoobtainrecombinantprotein.【Method】TheNS1geneofH9N2subtypeinfluenzaAviruswasamplifiedbyRT-PCR,andthenclonedintoprokaryoticexpressionvecto
5、rpET-28a(+).TherecombinantplasmidpET-NS1wasextractedafterbeingtransformedintoE.coliBL21-DE3competentcells.RestrictionenzymesdigestionandsequencesanalysisdemonstratedthattherecombinantplasmidcarryingNS1wasinsertedintocorrectopenreadingframe.【Result】TherecombinantproteinofNS1about26kDwasproduce
6、dafterinductionwith5mmol·L-1lactose.Thewestern-blottingtestshowedthattherecombinantproteinreactedwithpositiveserafrompigs,notwithnegativesera.TheOD650valuedifferencewasdistinctlythatthepositivesera1280folddilutionisabout3timesofthenegativesera.【Conclusion】Theseresultshavelaidasolidfoundationf
7、ordevelopinganeffectivediagnosticmethod.Keywords:Swineinfluenzavirus;NS1;Antigenicity2期王方昆等:H9N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆表达及反应原性分析5910引言【研究意义】猪流感是世界上最常见的猪传染病之一,传播迅速,常引起急性呼吸道疾病暴发。因为在单独感染的情况下很少引起死亡,长期以来猪流感的免疫在世界各国都没有引起足够的重视,在中国,使用猪流感病毒(swineinfluenzaviru
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