猪囊尾蚴T24基因的克隆、表达与免疫原性分析

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1、摘要从猪囊尾蚴中提取总RNA，用Oligo软件设计T24基因特异性引物，通过RT-PCR扩增出716bp的片段，扩增产物连接到pGEM．TEasy载体中，经酶切鉴定、PCR分析和测序后证明，所克隆的716bp片段含T24蛋白基因完整的开放阅读框(ORF)，其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列与Genbank登录的T24基因相应序列的同源性分别是98％和100％。将重组质粒pGEM—T24和原核表达载体pGEX．4T_1分别用EcoRI和SalI酶切，亚克隆T24基因至原核表达载体pGEX一4T-1中，转化大肠杆菌BL21，经酶切、PCR和测序鉴定证明，T24基因正确插入到pGEX一4T

2、．1载体。用ITPG诱导表达，表达产物通过SDS—PAGE和Western．blotting分析证实T24基因在大肠杆菌中成功表达，目的蛋白与GST形成融合形式，分子量大小为40ku左右，能被猪囊尾蚴阳性血清所识别；将表达产物免疫小鼠，进行间接ELISA检测，其抗血清能与猪囊虫粗抗原及纯化的T24重组融合蛋白产物发生免疫学反应。将重组质粒pGEM．T24和真核表达载体pPIC9K分别用EcoRI和NotI酶切，亚克隆T24基因至真核表达载体pPIC9K中，转化大肠杆菌JMl09，筛选阳性克隆提取pPIC9K—T24。用SalI内切酶线性化重组质粒pPIC9K—T24，然后电转化毕赤

3、酵母GSll5。采用G418浓度梯度法对所有在营养缺陷型选择培养基MD上生长出的转化子进行筛选，获得的高拷贝重组菌株。用PCR检测表明有目的基因整合。用1％甲醇诱导表达重组菌株，通过SDS—PAGE、Western—blotting对表达产物进行分析，结果表明T24基因在毕赤酵母中成功表达，表达产物的分子量为21ku左右，能被人囊虫阳性血清所识别。本研究克隆了猪囊尾蚴T24基因，分别在原核和真核表达系统中进行了表达，证实其表达产物具有免疫原性，从而为研制猪囊尾蚴基因工程疫苗提供了理论依据和实验材料。关键词：猪囊尾蚴，T24基因，原核表达，真核表达，免疫原性AbstractTotal

4、RNAwasextractedfromCysticercuscellulosae，theT24genespecificprimersweredesignedusingOligosoftwareA716bpspecificfragmentwasamplifiedbyRT-PCRandligatedintopGEM-TEasyvectorItwasidentifiedbyrestrictionendonucleaseanalysis，PCRandsequencingthatthefragmentcontainedthecompleteopenreadingframe(oRy)ofthe

5、T24geneThehomologiesofthenucleotidesequenceandencodingaminoacidsequencewere98％and100％respectivelycomparedwiththesequencepublishedinGenebankTherecombinantplasmidpGEM—T24wasdigestedwithEcoRIandSail，releasingtheT24genefragmentThefragmentsubsequentlyWasinsertedintotheEcoR1andNot1sitesoftheprokaryo

6、ticexpressionvectorpGEX一4T-IandwastransformedintoE．coliBL21，thisconstructWasalsosequencedtoensurefidelityExpressionoftherecombinantplasmidWasinducedbyIPTGinEcoliresultinginahighlevelofproteinexpression．TheexpressedproductswereanalyzedbySDS—PAGEandWestern—bloRingTheresultsofSDS-PAGEshowedthatth

7、e40kuT24GSTfusionwasexpressedsuccessfully．Western—blowingshowedgoodimmunoreactiVityoftheexpressedproductTheexpressedproductwasusedtoimmunizemice．TheantiserawerecollectedfromtheimmunizedmiceandexaminedbyELISATheresultsshowedthatimmunizat