理工论文ｈ１ｎ２亚型猪流感病毒ｎｓ１基因的克隆与序列分析

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2、囊液中提取H1N2亚型猪流感病毒的RNA，设计一对特异性引物，采用反转录-聚合酶链反应成功地扩增了NS1基因。将NS1基因的cDNA克隆后进行了序列测定，所扩增的片段包含了完整的NS1基因的开放阅读框，并将该毒株与参考毒株进行了核苷酸及氨基酸序列同源性比较分析。　　关键词NS1基因；克隆；序列分析　　中图分类号Q781文献标识码A文章编号1007-5739（2008）22-0217-02　　　　猪流感病毒是正粘病毒科A型流感病毒属中的成员，其基因组由8个RNA节段组成，其中NS基因是最短的，它含有2个读码框，

3、可编码NS1和NS22种蛋白质。非结构蛋白NS1的基因序列高度保守，具有抗原性[1]，在SIV检测中具有广阔的应用前景。本试验对该H1N2亚型猪流感病毒NS1基因进行克隆和序列分析，以期为后续研究提供参考。　　　　1材料与方法　　　　1.1试验材料　　Trizol，载体pMD18-T、TOP10感受态细胞、RT-PCR试剂盒，AgaroseGelDNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒，限制性核酸内切酶和EcoRⅠ、XhoⅠ，T4DNA连接酶。猪流感毒株：A/Swine/Guangdong/1999（H1N2）。　　

4、1.2引物设计与合成　　使用Oligo5.0引物设计软件，参考已发表序列，设计如下一对引物：上游引物：5′-ATGGATTCCAACACTGTGC-3′；下游引物：5′-GGCTGCATGAATGTTATT-3′。　　1.3病毒RNA的提取　　取250μL鸡胚培养尿囊毒液，参照文献[2]相关方法，提取总RNA。将RNA溶于无RNase水中，置-70℃备用。　　1.4目的基因的扩增　　1.4.1病毒RNA反转录。在1μLRNA溶液中依次加入：MgCl24μL，10×RNAPCRBuffer2μL，RNaseFr

5、eedH2O8.5μL，2.5mol/LdNTPMixture2μL，RNaseInhibitor0.5μL，反转录通用引物Uni12（5′-AGCAAAAGCAGG-3′）1μL，AMVReverseTranscriptase1μL，共20μL，轻轻混匀，放入PCR仪中，30℃8min、50℃30min、99℃5min、5℃5min，所得产物即为cDNA。　　1.4.2PCR扩增。取5μLcDNA作为模版，依次加入MgCl26μL，10×PCRBuffer10μL，d2H2O76μL，Taq酶1μL，上、下

6、游引物各1μL，共100μL，轻轻混匀。置PCR仪中，94℃预变性2min、94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸3min，进行35个循环，72℃延伸10s。取5μL进行琼脂糖凝胶电泳。　　1.5克隆和序列测定　　按pMD18-T载体试剂盒说明书进行DNA与载体质粒的连接，连接产物按常规方法转化TOP10感受态细胞。挑取白色可能的阳性菌落，提取质粒，进行PCR扩增和EcoRⅠ、XhoⅠ酶切鉴定。初步鉴定阳性克隆送生物公司测序。　　1.6序列比较分析　　用DNAstar软件进行序列比较分析。参考毒株包括

7、Genebank中已公布序列A/Swine/Zhejiang/1/2004（H1N2）、A/Swine/Pingtung/7-12/1999（H1N2）、A/Swine/HongKong/126/1982（H3N2）及试验对比毒株A/Swine/Guangdong/1999（H3N2）。　　　　2结果与分析　　　　2.1RT-PCR　　扩增出的DNA片段约780bp（图1）。　　2.2阳性克隆的初步鉴定　　挑选的克隆提取质粒PCR、酶切鉴定与预测的结果一致，初步认为获得了NS1基因的阳性克隆（图2、图3）。　

8、　2.3目的基因的核苷酸序列分析　　经序列测定，测得插入重组质粒中的外源DNA片段包含了完整的NS1基因的开放阅读框（660bp）和上下游引物序列、蛋白质合成的起始密码子和终止密码子，表明已成功地克隆到了NS1的全长基因。　　2.4目的基因与参考毒株的核苷酸及氨基酸同源性比较　　经序列比较分析，猪流感毒株Guangdong/1999（H1N2）与参考毒株HS1基因核苷酸及氨基酸同源性如表1所示。可以