抗体效价的Elisa测定

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1、实验五酶联免疫吸附测定BSA抗体效价1.目的要求(1)学习酶联免疫吸附测定的基本原理。(2)掌握酶联免疫吸附测定技术，抗体的效价测定及酶联免疫测定仪的使用。2.基本原理免疫酶技术:酶标Ab/Ag,酶结合物的酶在免疫反应后，作用于厎物后显色，根据颜色的有无和深浅，定量测定Ab/Ag。免疫反应：一次或数次具Ag,Ab特异的免疫学反应酶促反应：只进行一次显示出生物放大作用，灵敏度ng,pg60年代初期，Averameas&Ram等建立了免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)利用特殊的交联剂研制出辣根过氧化物酶---人血清白蛋白及酸性磷酸酯酶---抗体，统称为酶标记物或酶

2、结合物，用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay简称为Elisa)-----是在免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。本法兼有灵敏度高和特异性强两方面的优点。1974年Voller等用聚苯乙烯微量反应板作为免疫吸附剂吸附抗体(抗原)，再与相应的酶标记物结合操作更方便，易重复灵敏度可高达ng（10-9g）至pg(10-12g)，(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)免疫标记技术应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗

3、原、抗原或抗体进行定性和定量测定标记抗体或抗原荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂镜检观察或进行自动化测定荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等直接在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上,对抗原抗体反应进行定性和定位研究酶------性能稳定、经济易得、底物无色、产物显色，便于检测常用的酶:碱性磷酸酯酶、辣根过氧化物酶(horseradperoxidase简称HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。酶标技术戊二醛法，过碘酸氧化法将酶与Ab交联在一起Ag-Ab-抗Ab-HRPTMB+H2O2产物（黄色，OD450)+H2O图一　　直接型Elis

4、a图二　　间接型Elisa图三双抗体夹心型ELISA图四固相抗体竞争型ELISA未知抗原量=A（1）-A（2）每次反应后都要反复洗涤？保证反应的定量反应防止重叠反应，引起非特异现象。Partiallypurified,inactivatedHIVantigensantigenspre-coatedontoanELISAplate部分纯化，灭活病毒抗原抗原涂到酶标板Patientserumwhichcontainsantibodies.IfthepatientisHIV+,thenthisserumwillcontainantibodiestoHIV,andthoseantibodieswi

5、llbindtotheHIVantigensontheplate.病人血清中含有抗体。如果病人是艾滋病毒+，那么这个血清含有艾滋病毒抗体，这些抗体可以绑定到病毒抗原板Anti-humanimmunoglobulincoupledtoanenzyme.Thisisthesecondantibody,anditbindstohumanantibodies.抗人免疫球蛋白耦合酶。这是继抗体，并结合人类抗体substratewhichchangescolorwhencleavedbytheenzymeattachedtothesecondantibody.基板而改变颜色，当裂解酶附二抗体HIV(h

6、umanimmunodeficiencyvirus)detectionpositivenegativeProteinproteininteraction---ELISA1.DirectelisadifferentepitopeCoatwithpreyproteinIncubatewithbaitproteinPimaryAbantibaitprotein-----直接酶联免疫吸附试验不同表位外套与猎物蛋白孵化与诱饵蛋白原发性抗体抗诱饵蛋白2.CompetitiveelisasameepitopeCoatwithbaitprIncubatewithprimaryantibodyantibai

7、tprandvariousconcentrationpreyprotein(竞争同一表位。外套与诱饵蛋白培养初级抗体抗诱饵蛋白及不同浓度的猎物蛋白)4.操作方法4.1包被特异性抗原:固体抗原(如蛋白质)用包被液稀释至10Oμg/ml，每凹孔加100μL，加盖置4℃过夜(37℃2h)，次日倾去凹孔内液体，用滴管取洗涤液在每孔中加3～4滴，静置3min后倾去，重复3次，将反应板扣放在滤纸上，以除净液体。4.2封闭:每孔中加入