elisa法检测抗体效价

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1、ELISA间接法检测抗体效价实验原理：ELISA（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay），酶联免疫吸附实验。指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。ELISA操作过程：（一）抗原包被（蛋白包被浓度一般是0.5ug-10ug）①准备ELISA酶标板，根据检测的量包被抗原。②用包被液（pH9.6，0.05MNaHCO3-Na2CO3溶液）梯度稀释抗原，包被100ul/孔，设置双复孔。③用保鲜膜密封酶标板，盖上盖，放在装有湿棉花的饭盒中，4℃过夜（16h-24

2、h）。（二）洗涤①取出酶标板，弃掉保鲜膜，甩掉其中液体，吸水纸上拍干。②加入洗涤液，300ul/孔，震荡，室温放置3min。甩掉其中液体，吸水纸上拍干。③共洗涤3次。④用纯水再洗两次。（三）封闭①用PBS配制好5%的FBS溶液（封闭液，现用现配）。②洗涤后加入封闭液300ul/孔。③保鲜膜密封酶标板，装饭盒中，37℃培养箱2h。④封闭之后无需洗涤。（四）一抗孵育①封闭快好前的30分钟准备好一抗（单克隆抗体），用封闭液稀释，稀释梯度1：1000，1：3000，1：9000，1：27000。同时设置空白组（空白封闭液），

3、阴性对照组（未免疫细胞上清），阳性对照组（多抗）。②加入一抗100ul/孔。③孵育：37℃，1h。（五）洗涤（六）二抗孵育①用封闭液稀释二抗，二抗稀释度是1：3000。②洗涤后，加入二抗，100ul/孔。①孵育：37℃，45min。（七）洗涤（洗涤五次，再用纯水洗涤两次）（八）底物显色①配制底物液（一块板用量，96孔，10ml）：1×甲液4.86ml+1×乙液5.14ml+4mgOPD（3-4粒），迅速混匀。待充分溶解后加入30%H2O250ul即可。注：OPD（邻苯二胺）有致癌性，操作时应戴手套。底物液需现用现配，

4、H2O2最后加，不然过一会儿就变黄了。②洗涤后加入底物液显色，100ul/孔。③室温避光反应5-10min。终止条件：目测阳性抗体孔已依次出现黄色，Blank孔尚无颜色时即可加入终止液。④预热酶标仪5min。TMB显色用450nm检测，OPD显色用492nm检测。（九）加入终止液加入终止液（20%稀硫酸）50ul/孔。（十）酶标仪检测A492（Tecan公司，型号Sunrise）加入终止液5min内，上机检测。超过5min检测有误差。ELISA反应中试剂配方：10×PBS配制：100mlNaCl……………………………

5、………8gKCl……………………………………0.2gNa2HPO4▪12H2O………………………3.58gKH2PO4………………………………0.24g加入超纯水80ml，充分溶解，HCl调节pH7.2-7.4，超纯水定容至100ml，过滤后4℃存放。包被液：1000mlNaHCO3………………………………2.93gNa2CO3………………………………1.59g加入500ml超纯水，调节pH值为9.6；补足超纯水至1000ml。4℃存放待用。洗涤液：500ml10×PBS………………………………50ml超纯水…………

6、………………………450mlTween20………………………………0.25ml封闭液：100ml（现用现配）10×PBS………………………………10mlFBS（胎牛血清）……………………5ml超纯水…………………………………85mlTween20………………………………0.1ml样品稀释液：100ml10×PBS………………………………10ml超纯水…………………………………90ml1×甲乙液：100ml（甲、乙液分别提前配好，临用前再取所需量混合）甲液：柠檬酸……………………………1.92g超纯水溶解，定容至100

7、ml。乙液：Na2HPO4▪12H2O…………………7.17g超纯水溶解，定容至100ml。滤过除菌，4℃存放待用。临用前，取甲液4.86ml与乙液5.14ml混合，加OPD4mg（有毒，戴手套,4粒），待充分溶解后加入30%H2O250ul，混匀即可。甲液2.47ml乙液2.53ml水5ml4粒OPD50ul过氧化氢终止液：100ml浓硫酸……………………………………20ml缓慢加入80ml超纯水中，边加边搅拌。