elisa检测抗体效价

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1、实验目的：实验材料：1、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、十二水磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、浓硫酸、Tween-20、BSA等。2、酶标抗小鼠IgG3、TMB溶液配制：1、抗原包被液：PH9.6的碳酸盐缓冲液（0.05M）批号：称取：Na2CO3（分子量105.99）1.59gNaHCO3（分子量84.01）2.9g加蒸馏水至1000ml，调PH值。滤膜（0.45μm）过滤，4℃保存。2、洗涤缓冲液(PBS-T)批号：PBS缓冲液1000mlTween-20:0.5ml调PH值至7.39。滤膜（0.45

2、μm）过滤，室温保存或4℃保存。3、封闭液（1.0%BSA/PBS-T）批号：洗涤缓冲液1000mlBSA:10g现用现配。4、血清稀释液(pH7.4PBS)：0.0067M(PO4+)5、洗涤用PBS(pH7.4),0.15M(PO4+)批号：称取：NaCl　　　　　　　8.0gNa2HPO4·12H2O　　2.9g　KH2PO4　　　　　0.2gKCl　　　　　　　　0.2g加蒸馏水至1000ml，调PH值至7.39。滤膜（0.45μm）过滤，室温或4℃保存。6、二抗稀释液：同洗涤缓冲液7、终止

3、液：2MH2SO4批号：水90ml浓硫酸10.64ml浓硫酸逐滴加入水中，不断搅拌，防止局部过热。4℃保存。实验器材：1、1ml枪头；200μl枪头；10μl枪头，。2、1.5mlEP管。3、移液器1ml、200μl、100μl、20μl、10μl、2μl。4、96孔板（costor，美国）。5、电子天枰。6、酶标仪（LabsystemsDragonMK3，芬兰）。7、洗板机（BIORADMODEL1575，美国）。8、电子pH计（SevenEasyS20）。方法步骤：1包被抗原：用μg/ml的蛋白

4、包被，每孔100μl。密封，4℃过夜。2洗板：取出预先4℃包被过夜的96孔板，用PBS-T洗液300μl/孔洗板5次，每次轻轻振荡，拍干。3封闭：每孔加入封闭液300μl/孔。封膜，37℃放置1h。5洗板：用PBS-T洗液300μl/孔洗板5次，每次轻轻振荡，拍干。6加一抗：96孔板上血清稀释倍数为1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800，共8个稀释梯度，具体操作如下：血清在Ep管中稀释成100倍：1：10：5μl原倍血清+45μl血清

5、稀释液；1：100：30μl10倍血清+270μl血清稀释液；按设计加入96孔板相应位置，然后依次按倍比稀释至200倍、400倍、800倍、1600倍、3200倍、6400倍、12800倍：1：400：100μl200倍血清+100μl血清稀释液；1：800：100μl400倍血清+100μl血清稀释液；1：1600：100μl800倍血清+100μl血清稀释液；1：3200：100μl1600倍血清+100μl血清稀释液；1：6400：100μl3200倍血清+100μl血清稀释液；1：12800

6、：100μl6400倍血清+100μl血清稀释液；所有样本加完后，封膜，37℃放置1h。7洗板：用PBS-T洗液300μl/孔洗板5次，每次轻轻振荡，拍干。8加酶标二抗：酶标抗小鼠IgG稀释5000倍：稀释过的酶标二抗液100μl/孔，封膜，37℃放置1h。9洗板：用PBS-T洗液300μl/孔洗板5次，每次轻轻振荡，拍干。10底物显色：底物显色液TMB直接使用，注意避光放置。100μl/孔，37℃避光放置，约10-20分钟。11终止反应：终止液2MH2SO4，100μl/孔。12测OD值：5min

7、内在酶标仪上震荡后读数，检测波长450nm。