实验六抗体效价的Elisa测定

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1、实验二酶联免疫吸附测定BSA抗体效价1.目的要求(1)学习酶联免疫吸附测定的基本原理。(2)掌握酶联免疫吸附测定技术，抗体的效价测定及酶联免疫测定仪的使用。2.基本原理免疫酶技术:酶标Ab/Ag,酶结合物的酶在免疫反应后，作用于厎物后显色，根据颜色的有无和深浅，定量测定Ab/Ag。免疫反应：一次或数次具Ag,Ab特异的免疫学反应酶促反应：只进行一次显示出生物放大作用，灵敏度ng,pg60年代初期，Averameas&Ram等建立了免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)利用特殊的交联剂研制出辣根过氧化物酶---人血清白蛋白及酸性磷酸酯

2、酶---抗体，统称为酶标记物或酶结合物，用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay简称为Elisa)-----是在免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。本法兼有灵敏度高和特异性强两方面的优点。1974年Voller等用聚苯乙烯微量反应板作为免疫吸附剂吸附抗体(抗原)，再与相应的酶标记物结合操作更方便，易重复灵敏度可高达ng（10-9g）至pg(10-12g)，(Enzyme-LinkedImmunosorbentAss

3、ay)免疫标记技术应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定标记抗体或抗原荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂镜检观察或进行自动化测定荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等直接在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上,对抗原抗体反应进行定性和定位研究酶------性能稳定、经济易得、底物无色、产物显色，便于检测常用的酶:碱性磷酸酯酶、辣根过氧化物酶(horseradperoxidase简称HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。酶标技术戊二醛法，过碘酸氧化法将酶与Ab交联在一起

4、Ag-Ab-抗Ab-HRPTMB+H2O2产物（黄色，OD450)+H2O图一　　直接型Elisa图二　　间接型Elisa图三双抗体夹心型ELISA图四固相抗体竞争型ELISA未知抗原量=A（1）-A（2）每次反应后都要反复洗涤？保证反应的定量反应防止重叠反应，引起非特异现象。Partiallypurified,inactivatedHIVantigensantigenspre-coatedontoanELISAplatePatientserumwhichcontainsantibodies.IfthepatientisHIV+,thenthisserumw

5、illcontainantibodiestoHIV,andthoseantibodieswillbindtotheHIVantigensontheplate.Anti-humanimmunoglobulincoupledtoanenzyme.Thisisthesecondantibody,anditbindstohumanantibodies.substratewhichchangescolorwhencleavedbytheenzymeattachedtothesecondantibody.HIV(humanimmunodeficiencyvirus)de

6、tectionpositivenegativeProteinproteininteraction---ELISA1.DirectelisadifferentepitopeCoatwithpreyproteinIncubatewithbaitproteinPimaryAbantibaitprotein-----2.CompetitiveelisasameepitopeCoatwithbaitprIncubatewithprimaryantibodyantibaitprandvariousconcentrationpreyprotein4.操作方法4.1包被特异

7、性抗原:固体抗原(如蛋白质)用包被液稀释至10Oμg/ml，每凹孔加100μL，加盖置4℃过夜(37℃2h)【已完成】次日倾去凹孔内液体，用滴管取洗涤液在每孔中加满稀释/洗涤液洗涤3次，首次洗涤静置2min后倾去，后两次静置1min。将反应板扣放在滤纸上，以除净液体。4.2封闭:每孔中加满封闭液（约300ul多），加盖或用封口膜封板，置37℃恒温箱60min，倾去孔内液体，按上法洗涤3次。4.3加待测血清(内含抗体)、阴性血清(无抗体)及稀释液(PBS/Tween):待测血清按倍比法用稀释液稀释(1:100、1:200等)，阴性血清也稀释成1:100，取不同

8、稀释度的待测血清，阴性血清及稀释液(PBS/Twee