抗体制备及效价测定讲义

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1、抗体制备及效价测定讲义实验一、兔抗人IgG制备一、实验材料1．实验动物：健康雄性家兔1只；2．抗原：纯化人IgGlmg；3．实验试剂：完全福氏佐剂（CFA），不完全弗氏佐剂（IFA），0.01MPBS（8gNaCl，0.2gKCl，2.9gNa2HPO4.12H2O，0.2gKH2PO4，以NaOH调节pH至7.2，加双蒸水至1000mL），普鲁卡因溶液，肾上腺素，硫柳汞，叠氮钠。4．实验用具：2.5mL、5mL注射器，10mL无菌小烧杯，塑料静脉插管，5mL无菌冻存管，250mL无菌三角瓶，50mL无菌尖底离心管。二、操作步骤1．抗

2、原制备：将纯化的人IgG用0.01MPBS（pH7.2）或生理盐水稀释成lmg/mL，加入等体积无菌CFA或IFA至5mL无菌冻存管中，置于超声波破碎仪上，粉碎头浸入液面下0.5-0.8cm，离瓶底距离0.5cm左右，以免打碎玻璃瓶，抗原置冰上，每次乳化10-15秒，间隔1分钟左右，反复乳化3-4次即。将乳化剂滴入冷水中，若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即乳化完全，为合格的油包水剂。2．家兔免疫：（1）家兔捉拿方法：一只手抓住兔的颈部皮毛，将兔提起，用另一只手托其臀，或用手抓住背部皮肤提起来，放在实验台上，如图1：图1家兔的捉拿方法

3、（2）初次免疫：在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处选择6-10处免疫接种点，采用肌内、皮下或皮内注射，每点注射上述乳化人IgG抗原0.2mL。（3）二次免疫：第一次免疫后间隔2周再以lmg/mL人IgG抗原加等体积IFA乳化后于后腿肌肉或背部皮下多点加强免疫。（4）三次免疫：第二次免疫后间隔1周再以lmg/mL人IgG抗原加等体积IFA乳化后于后腿肌肉或背部皮下多点加强免疫。（5）终末免疫：第三次免疫后间隔1周再以lmg/mL人IgG抗原加等体积IFA乳化后于后腿肌肉或背部皮下多点加强免疫。3．试血：末次免疫7天后经

4、兔耳缘静脉采血2mL，分离血清，用琼脂双向扩散实验测定抗体效价达1:16以上（稀释抗体），即可放血，如效价不高，继续加大剂量，加强l-2次后，再行检测。4．颈动脉放血：（1）将免疫家兔仰面固定于固定架上，头部放低，暴露颈部。（2）沿颈部中线用2％普鲁卡因溶液局部麻醉，15分钟后剪开颈中部皮肤10cm长。沿气管钝性分离皮下组织，暴露气管前的胸锁乳突肌。（3）分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，在肌束下面靠近气管两侧，可见淡红色搏动的颈动脉，将双侧动脉仔细分离，于每侧动脉分别套入两根棉线，一根在远心端，一根在近心端。（4）腹腔内注射

5、肾上腺素1mg，以升高血压，加快心率，避免因放血后血压降低造成凝集而影响取血量。（5）先将一侧动脉远心端丝线结扎紧，然后在近心端用止血钳夹住（止血钳头部用细塑料管包裹，避免损伤动脉）。用小的尖头眼科剪刀在两侧丝线中间的动脉壁上剪开一个小口，以便插入塑料静脉插管，再用近心端棉线固定静脉插管，避免其从动脉内滑出。（6）轻轻松开止血钳，血液很快射入玻璃瓶皿，直至血流缓慢点滴而出时，以同法在对侧动脉内插管放血，并将动物固定架后端抬高，增加放血量，一般一只家兔可放血80-100mL。5．血清分离：（1）将血液置室温中凝固约1小时，然后置4℃过夜

6、，使血块收缩。（2）用无菌移液管吸取上层血清，转移至50mL无菌尖底离心管中。（3）将血块自容器壁分离，将血清全部倾入另一50mL无菌尖底离心管，在4℃下2500g离心30分钟，取上清液即血清部分与前面的血清混合。（4）将混合血清4℃1500g离心30分钟，弃沉淀收集血清。6．抗血清保存（1）4℃保存：将抗血清除菌后，加入0.0l％硫柳汞或0.1％叠氮钠，液体状态保存于普通冰箱，可以存放3个月到半年，效价高时，一年之内不会影响使用。（2）低温保存：将抗血清除菌后，加入等量甘油，放在-20℃或-40℃，一般保存5年抗体效价不会有明显下降

7、。抗体切忌反复冻融，反复冻融会使抗体效价显著降低。实验二、兔抗苏云金芽孢杆菌抗体制备一、实验材料1．实验动物：健康雄性家兔1只；2．抗原：苏云金芽孢杆菌；3．实验试剂：LB固体培养基，0.01MPBS，甲醛溶液，普鲁卡因溶液，肾上腺素，硫柳汞，叠氮钠。4．实验用具：2.5mL、5mL注射器，10mL小烧杯，塑料静脉插管，5mL无菌冻存管，250mL无菌三角瓶，50mL无菌尖底离心管。二、操作步骤1．抗原制备：斜面生长的抗原性完整的苏云金芽孢杆菌菌体，进行细菌计数，用含0.3％甲醛的0.01MPBS（pH7.2）制成浓悬液，37℃孵育2

8、4小时，无菌实验合格后倾入50mL无菌尖底离心管，在4℃下1010000g离心10分钟，取沉淀用0.01MPBS稀释至1×10个细菌/mL，置4℃备用。2．免疫前试血：兔耳缘静脉采血1mL，分离血清，与苏云金芽孢杆菌进行