《高效液相色法》PPT课件

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1、六、高效液相色谱法高效液相色谱法：以高压输出的液体为流动相的色谱技术。HighPerformanceLiquidChromatographHPLC高效液相色谱法的特点1.高压：对流动相施加高压，使其迅速地通过色谱柱液；2.高效：分离效率大高，甚至可实现手性分离；3.高灵敏度：采用高灵敏度的检测器;4.速度快：与经典液相色谱法相比，高效液相色谱法所需的分析时间较少，一般少于1h；5.应用范围更广。HPLC与GC的比较相同点：具分离和分析功能，均可以在线检测。不同点：分析对象GC：适于能气化、热稳定性好、沸点较低的样品，不

2、适于高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品。占有机物的20%。HPLC：不受样品挥发性和热稳定性的限制，适于溶解后能制成溶液的样品；分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品。占有机物的80%以上。流动相GC：流动相为惰性气体，如H2、N2、He、Ar；组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用。HPLC：流动相为液体；流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度，增加了额外因素，如流动相极性、pH值、不同比例的两种或两种以上液体的配比。流动相种类较多，选择余地广。GC：加温操作。HPLC：

3、室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）。操作条件第一节高效液相色谱仪主要部件：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。辅助装置：脱气机、梯度洗脱装置、自动进样装置、数据处理系统。组成部件基本流程一、高压输液系统包括：由贮液瓶、高压泵、脱气机、梯度洗脱等装置。1．溶剂脱气装置作用：防止溶解在溶剂（流动相、试样）中的N2、O2进入检测器而使噪声剧增。脱气方式：氦气鼓泡、超声波脱气、真空脱气等。2．高压泵作用：输送流动相。无脉动或脉动极小，保证输出的流动相具有恒定的流速。要求：具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等。作

4、用：分离过程中改变流动相的组成，使所有峰都获得最佳分离效果，分析时间缩短。基本方式：高压梯度、低压梯度。2．梯度洗脱高压梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。低压梯度：一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。如双元梯度、四元梯度等。二、进样系统进样方式：隔膜注射器进样停留进样阀进样自动进样器进样1．隔膜注射器进样色谱柱顶端装一耐压弹性隔膜，进样时用微量注射器刺穿隔膜将试样注入色谱柱。优点：装置简单、价廉、死体积小。缺点：是

5、允许进样量小，重复性差，只能用于低压系统(<10MPa,压力高了，密封垫会泄漏)。2．停留进样停止流动相流动后再进样，以防止泄漏，可用于高压。缺点：重新升压后会产生不稳，保留时间和峰形重复性比较差。3．阀进样结构和作用原理与气相色谱中所用的六通阀相同。优点：进样准确，重复性好，适用于定量分析，更换不同体积的定量管，可调整进样量。4．自动进样由计算机自动控制定量阀，按预先编制好的程序进行进样。优点：可自动完成几十或上百个样品的分析。在进行大量样品的分析时，使用自动进样器操作可节省大量人力和时间。缺点：装置成本高。三、色谱

6、柱组成：包括柱管和固定相两部分。柱管材料通常采用优质不锈钢，柱长一般为5~40cm，内径为1~6mm。色谱柱的两端有烧结不锈钢或多孔聚四氟乙烯过滤片，以防止柱内的填料流出。填充好固定相后的柱子有方向性，在使用时，应使流动相的方向与柱子管外箭头标的方向一致。四、检测器检测器类型最高灵敏度（g/mL）温度影响流速影响用于梯度洗脱紫外光度(UV)选择性510-10低无可以示差折光(RI)通用性510-7有无不可荧光(FD)选择性10-12~10-9低无可以红外吸收(IR)选择性~10-7低无可以极谱选择性10-10~10

7、-9有有困难电导选择性10-9有有不可质谱通用性~10-8无无可以1．紫外检测器应用最广：适于约有70％的样品。灵敏度高：线性范围大：死体积小：（1mm×10mm，8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感。分类：固定波长型、可调波长型和二极管阵列检测器。特点：固定波长：254nm或280nm固定波长紫外检测器2．荧光检测器工作原理：利用某些试样具有荧光特性进行检测。特点：高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；3．示差折光检测器工作原理：折光指数与组成有

8、关，连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；特点：通用型检测器；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱。分类：偏转式、反射式和干涉型三种。偏转式：它是基于折射率随介质中的成分变化而变化，如入射角不变，则光束的偏转角是流动相(介质)中成分变化的函数。因此，测量折射角偏转值的大小，便可得到试样的浓度。第二节