高效液相色法分离芳香烃课件.ppt

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1、高效液相色法分离芳香烃化学化工学院仪器分析实验室实验目的了解高效液相色谱仪的结构；学习高效液相色谱仪的基本操作方法；了解用反相液相色谱法分离芳香烃的基本原理；掌握用保留时间定性和归一化法定量的分析方法。高效液相色谱分离系统由固定相和流动相组成。用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相称为正相分配色谱，适宜于分离极性化合物；用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相称为反相分配色谱，适宜于分离非极性或弱极性化合物。本实验中，固定相为C-18柱，它是用C-18烷基键合硅胶基质上作固定相；流动相为极性溶剂甲醇和

2、水(反相)。实验原理1.高效液相色谱分离系统各组分在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。这与萃取的基本原理相同，均服从分配定律：K=C固/C液，K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。2.高效液相色谱检测系统由于苯系物在紫外区有较强的吸收，故采用UV检测器进行检测。3.高效液相色谱的定性和定量基本依据是相同的物质在相同的色谱条件下应该有相同的保留时间（但相反结论却不成立）。保留时间定性分析未知峰保留

3、时间与某标准物完全相同，可初步确定为同一物质；改变色谱柱或流动相组成，二者保留值仍完全相同，则可认定为同一物质。色谱定量分析的依据是混合物中各组分的含量与其相应的响应信号（峰高或峰面积）成正比，如果被分析试样中所有组分都能流出色谱柱，并产生信号，利用归一法即可计算出各组分的含量。由于不同物质在检测器中响应值大小不一样，定量分析首先需要测出各组分的相对较正因子。以已知浓度C1、C2的甲苯、乙苯对应色谱峰面积A1、A2来计算相对较正因子。以甲苯为参照，则令待测样中甲苯、乙苯浓度C1′、C2′对应的色谱峰面积A1′、A2′，则面积归一法定量分析

4、仪器结构输送系统：高压输液泵进样系统：注射器，六通阀分离系统：C-18柱检测系统：紫外吸收检测器数据处理：色谱工作站高效液相色谱型号：LC2000六通阀进样状态切换示意图1柱泵324定量圈进样孔6废液5废液Inject6柱泵3214定量圈进样孔废液5废液Load六通阀连接示意图1.流动相的准备（配制80%的甲醇溶液，过滤，超声波脱气10-20分钟）2.打开HPLC(包括计算机工作站、色谱仪、泵)，连接好流动相管道，连接检测系统。4.有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。逆时针旋松排放阀旋纽，开启泵开关，再按PRUGE键

5、进行冲洗，排尽管路空气（废液管中无气泡为止，冲洗速度不要超过10ml/min）。按PRUGE键，关闭冲洗，顺时针旋紧排放阀旋纽。5.通过工作站观察基线，如基线在较高位置，可进行基线归零。根据样品测量条件和要求建立测量方法文件。6.用进样针向六通阀进样，进样体积应为定量环体积的2-5倍。进样时先将进样针插入进样器，再顺时针旋进样阀门至采样位，将样品全部打入，再将进样阀逆时针旋回原位，等5s后将进样针取出。7.分析完后，用纯甲醇冲洗色谱柱40~60min。清洗完后，先停流，关闭高压泵，再关仪器电源。数据分析完毕后，再关闭色谱工作站。高效液相色

6、谱仪操作步骤仪器操作注意事项1.流动相使用前必须经过脱气（以除去其中溶解的气体，以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能）。2.实验结束后采用蒸馏水清洗进样器。3.实验结束后应用纯溶剂清洗色谱柱，并取下柱子，封住两头。4.进样注意进样量应为定量圈量的2-5倍，以便有过量的样品液来取代管壁上的流动相，进样精密度高。当样品量少时，采用部分体积进样，进样量由微量注射器手动控制，要求：不得超

7、过定量圈体积的1/2量，否则，部分样品将会从出口流失。使用微量进样器，须清洗干净，进样时应先排除气泡；进样前应用流动相冲洗进样孔，以除去前一针留下的样品。进样阀的废液出口端高度必须与进样针在同一水平位置，以免虹吸作用，使样品向针筒方向回流，或从废液口流出。1.标准样品的配制用甲醇配成浓度为10mg/mL的甲苯，乙苯标准样品。2.开启高效液相色谱仪先冲洗泵和进样阀，关闭冲洗，等待基线稳定。3.标准样样品的检测待记录仪基线平稳后，分别进甲苯，乙苯标准样各60μL，记录保留时间和峰面积。4．未知样品的检测进待测试剂60μL，记录保留时间和峰面积

8、。实验步骤1．测定每一个标准样的保留时间2．测定待测样中每一个峰的保留时间，与标准样品色谱图比较，标出每个峰代表的化合物。3．用标准峰的峰面积，计算待测样中各化合物的含量。数据处理