《细胞培养》课件

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1、细胞培养：将动物组织或细胞分散成单个细胞，在模拟　　　　　　　机体内的生长环境条件下，使其在体外环境　　　继续生长增殖的过程，称之为细胞培养。体外培养：原代培养(primaryculture亦称初代培养)传代培养(subculture,亦称继代培养)。2.3细胞的基本培养技术原代培养：是指将机体取出的组织或细胞进行初次培养的　　　　　过程。初次培养的细胞大约增殖10代左右，这　　　　样的细胞称为原代细胞(primarycell)传代培养：从原代培养的细胞继续转接培养称为传代培养。在invitro条件下

2、持续传代培养的细胞称为传代细胞(subculturecell)。2.3细胞的基本培养技术2.３.1原代培养(1)组织取材(2)组织细胞的分离(3)培养方法2.3细胞的基本培养技术取材：鸡胚组织鼠胚组织皮肤和黏膜血细胞内脏和实体瘤2.3细胞的基本培养技术组织细胞分离：机械法——离心(500-1000rpm)切割分散机械分散消化法——胰蛋白酶消化胶原酶消化螯合剂消化2.3细胞的基本培养技术2.3.2传代培养第一次传代成功与否——细胞形成单层的面积细胞活性常规传代(1)贴壁细胞的消化法传代(2)悬浮细胞传代2.3细

3、胞的基本培养技术2.3细胞的基本培养技术2.3细胞的基本培养技术PBS清洗加胰酶2.3细胞的基本培养技术2.3细胞的基本培养技术2.3细胞的基本培养技术贴壁细胞传代时应注意问题：选择适当时机不同细胞区别对待消化液浓度适宜细胞接种数量适当多些部分贴壁细胞可不经消化处理直接吹打2.3细胞的基本培养技术2.3.3常用培养技术悬滴培养培养瓶培养旋转管培养克隆培养法细胞同步化培养动物细胞的大规模培养2.3细胞的基本培养技术1907年Harrison单盖玻片培养1925年Maxinmow双盖玻片培养2.3.3.1悬滴培养

4、2.3细胞的基本培养技术2.3细胞的基本培养技术2.3.3.3旋转瓶培养2.3.3.4克隆培养法克隆培养法:又称单细胞分离培养法，就是将从细胞悬液中获得的单个细胞用于培养，使之重新繁衍成一个新的细胞群体的培养技术。细胞株:克隆培养所获得的培养产物遗传特性几乎完全相同，即培养得到的后裔细胞群来源于一个共同的祖细胞，成细胞株（cellstrain)2.3细胞的基本培养技术影响克隆形成率的因素接种的细胞密度培养基血清饲养细胞激素和生长因子CO2适应性生长基质2.3细胞的基本培养技术克隆培养技术稀释铺板法饲养层克隆法

5、胶原膜板或血纤维蛋白膜层板克隆法琼脂克隆法多孔塑料培养板单细胞克隆法2.3细胞的基本培养技术2.3.3.5细胞同步化培养细胞周期的不同阶段，细胞体积、密度、黏附度、吸光性等特征都有区别。选择细胞同步化：(1)M期细胞震摇脱落法(2)离心洗脱法(3)密度沉降法2.3细胞的基本培养技术诱导细胞同步化：(1)血清饥饿法G1期(2)异亮氨酸营养缺乏法G1期(3)DNA合成抑制剂阻断法S期(4)秋水仙素阻断法有丝分裂中期2.3细胞的基本培养技术细胞系：初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。细胞株：从一个

6、经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。2.4细胞系和细胞株的建立2.4.1建立细胞系（或株）的要求组织来源：物种、年龄、性别、器官或组织细胞生物学检测：形态、结构、生长曲线、分裂指数、倍增时间、接种率、分泌产物培养条件和方法：培养基、血清种类、用量2.4细胞系和细胞株的建立细胞冻存——冻存液70%培养基+20%血清+10%DMSO结合细胞中水分子,降温时减少冰晶形成2.5细胞的冻存、复苏与运输细胞冻存:2.5细胞的冻存、复苏与运输细胞复苏贴身运输冰瓶运输液

7、氮罐运输细胞运输2.5细胞的冻存、复苏与运输细胞培养的污染问题十分重要，一旦发生污染，将导致前功尽弃。所以细胞培养一定要建立无菌观念。遇到培养污染要分析原因，及时处理。2.6培养细胞的污染、检测及防止2.6.1污染判定出现以下情况，培养的细胞可能有污染：培养液的酸碱度发生异常的改变。培养液出现混浊。光镜观察到菌丝和颗粒。细胞出现死亡或增殖缓慢等。2.6培养细胞的污染、检测及防止2.6.2污染途径空气器材操作血清组织样本2.6培养细胞的污染、检测及防止2.6.3污染物细菌酵母菌真菌支原体病毒等2.6培养细胞的污

8、染、检测及防止革兰氏阴性菌2.6培养细胞的污染、检测及防止2.6培养细胞的污染、检测及防止真菌2.6.4污染物的检测支原体检测:支原体污染细胞后，能抑制细胞代谢和生长，改变核酸合成，影响细胞的抗原性，引起细胞染色体改变，具有类病毒作用。在培养细胞初期，由于支原体对细胞的繁殖影响较小而往往被忽略。2.6培养细胞的污染、检测及防止1）荧光技术检测：支原体含有DNA，能与一种荧光染料Hoechest332