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《不同破壁方法提取真菌DNA的比较_周万青》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、212临床检验杂志2009年第27卷第3期ChineseJournalofClinicalLaboratoryScience,2009,Vol27,No3文章编号:1001-764X(2009)03-0212-03中图分类号:R446.6文献标识码:A研究生园地*不同破壁方法提取真菌DNA的比较1,22222周万青,李芳秋,王立魁,邵海枫,史利宁(1.江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏镇江212013;2.南京军区南京总医院解放军临床检验医学研究所中心实验科,南京210002)摘要:目的探索和评价
2、提取致病性真菌DNA的简便方法。方法分别用6种方法(液氮冻融、-70冻融、溶胞酶消解、超声破碎、高盐溶液、尿素溶液)裂解真菌细胞壁,再用市售DNeasyBlood&TissueKit试剂盒提取DNA,最后通过对提取物进行比色定量和PCR检测评价各种提取方法的优弊。结果酶消解破壁法提取真菌DNA效率最高,重复性良好。模拟全血标本23中白色念珠菌检测限为10个孢子,烟曲霉及新型隐球菌检测限为10个孢子。结论酶消解破壁法提取真菌DNA在6种方法中效率最高,可用于临床常见真菌感染的PCR快速诊断。关键词:真菌;DNA;提取;P
3、CR37由于真菌细胞壁成分复杂,难以得到充分裂解,稀释为10/ml~10/m。l分别取各稀释度菌液10真菌中富含的多糖、色素、核酸酶等物质使得核酸的l加入到500l全血混匀,模拟临床全血标本。各15分离更加困难。已报道的真菌破壁方法有:液氮冻管含菌量分别为10~10个孢子。另制备白色念[1][2][3][4]融、-70冻融、酶消解、超声破碎、高盐珠菌和烟曲霉纯培养物各30mg,用于比色法定量[5][6]溶液、尿素缓冲液处理。本文以比色定量和考察DNA提取效果。PCR测定结果为评价标准,探讨基于以上6种破壁1.4模拟
4、全血标本的处理500l含真菌的血标方法的DNA提取效果,报告如下。本置无菌的1.5mlEP管中,加1ml红细胞裂解液1材料和方法(10mmol/LTris-HCl、pH7.6,5mmol/LMgCl2,101.1主要试剂及仪器TaqDNA聚合酶及dNTPsmmol/LNaCl),37孵育10min,5000g离心10(Promega公司),蛋白酶K(Merck公司),溶细胞酶min,弃上清,重复一次。沉淀加500l白细胞裂解(lyticase)和十二烷基肌氨酸钠(Sigma公司),液(10mmol/LTris-
5、HCl、pH7.6,10mmol/LEDTA,DNeasyBlood&TissueKit(Qiagen公司),山梨醇50mmol/LNaC,l2g/LSDS,200g/ml蛋白酶K),(Amersco公司),异硫氰酸胍(Serva公司),BioDL-652h,然后5000g离心15min,弃上清。沉淀2000DNAMarker(杭州博日公司);超声破碎仪物用下述6种方法分别进行真菌孢子破壁处理后提(JY-250),PCR扩增仪及紫外分光光度计(Eppen-取DNA。dorf公司),凝胶成像分析系统(捷达公司)。1.5真
6、菌孢子的破壁及DNA提取1.2标准菌株本科微生物实验室保存的标准菌1.5.1溶胞酶消解法加入600l山梨醇缓冲液株:白色念珠菌(日本C1株)、新型隐球菌(国家临(1mol/L山梨醇,100mmol/LEDTA,14mmol/L-检中心质控菌株)及烟曲霉(A1株,由中科院皮肤巯基乙醇),200U溶细胞酶,3030min,300g病研究所馈赠)。离心10min,沉淀用180lATL缓冲液(Qiagen公1.3菌种培养及样本制备白色念珠菌和新型隐司组织裂解液)重悬。球菌接种沙氏平板培养基培养,3072h,收获
7、孢1.5.2超声破碎法加入600l山梨醇缓冲液,子并制备悬液;烟曲霉接种沙氏斜面培养基培养,30超声处理180w60s。72h,用生理盐水(9g/LNaCl)冲洗菌落获得分1.5.3-70冻融法加入600l山梨醇缓冲生孢子,并在旋涡振荡器上剧烈振荡使成单个孢子,液,置-70(95%酒精浴)10min,室温融化,重复离心收集上清中单个孢子悬液。用细胞计数板计数3次。9各种孢子浓度并调整为(1~5)10/ml。然后系列1.5.4液氮冻融法加入600l山梨醇缓冲液,*基金项目:南京军区医学科技十一五研究
8、计划重点项目(06Z43)。作者简介:周万青,1981年生,男,硕士研究生,从事微生物学研究。通讯作者:李芳秋,E-mai:lnjlifq@jlonline.com。临床检验杂志2009年第27卷第3期ChineseJournalofClinicalLab
