真菌dna提取及扩增方法

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1、一真菌DNA提取方法取已纯化的真菌菌丝。采用改良氯化苄法提取DNA。具体方法如下：（1）0.1g菌体，在1.5ml离心管中加入500μLDNA提取液，先振荡使之充分混匀。（2）10%SDS100μL和300μL氯化卞，剧烈振荡，涡旋混匀，使管内混合物成乳状。（3）于56℃水浴保温1h，每隔10min振荡混匀一次。（4）加入3M醋酸钠（pH5.2）300μL，冰浴15min12000rpm，4℃离心15min。（5）收集上清液（约600μL，记住收集的上清液的体积），放入另一新离心管中，再加入等体积的氯仿：异戊

2、醇（V：V=24:1）剧烈振荡使之充分混匀，并形成悬乳状。12000rpm，4℃离心15min。（6）如上5操作再抽提一次，移至另一新离心管中。（7）加入两倍体积的冷无水乙醇，上下转动混匀，放入-20℃冰箱过夜，使DNA沉淀。（8）12000rpm，4℃离心15min，收集沉淀。（9）沉淀用1000μL75%冷乙醇洗涤5min，重复两次，然后弃去冷乙醇。（10）真空干燥，将DNA溶于50μLTE缓冲液或ddH2O中，4℃冰箱保存备用。二真菌的PCR扩增以提取的基因组DNA为模板，用真菌通用引物ITS4（5′-

3、TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)对真菌rDNA的ITS区域利进行PCR扩增。PCR反应体系（25）µL：PCRBuffermaxture2.5µL；10mmol/LdNTP1µL；引物ITS4/ITS5(10µmol/L)各1µL；模板DNA2µL；5U/µLTaqDNA聚合酶0.4µL；ddH2O17.1µL。PCR反应程序：95℃预变性4min，94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸40s，进行35个循环，最后7

4、2℃延伸7min，用无菌水代替模板作阴性对照，PCR产物-20℃保存。细菌和古菌4.1.1.1酶法小量DNA提取1．50mg菌体(或直接用竹签挑取纯菌落)于EP管中，加1×TE480ul，稀释成20mg/ml的溶菌酶20μL，放入37℃摇床2—3小时；2．加20%SDS50μL及蛋白酶pK5μL震荡混匀1分钟,放入55℃摇床（或烘箱）30-60分钟〔pK浓度为20ug/mL〕；3．加550μL苯酚:氯仿:乙戊醇（25：24：1）取下层,震荡混匀，12000rpm离心10分钟,吸取上清液(不要吸到中间渣滓，重复

5、抽提2次)；4．上清液加入50μL3mol/L乙酸钠(PH4.8-5.2)混匀后加500μL异丙醇，放入-20℃冰箱1-2小时或过夜；或者加800ul无水乙醇，加80μL3mol/L乙酸钠(PH4.8-5.2)室温放置10分钟以上；5．12000rpm离心10分钟，去除上清液,加200μL70%乙醇，轻摇洗盐1—2次，12000rpm低温离心5分钟，弃乙醇；6．(37-55)℃干燥后加1×TE50μL溶解DNA(视DNA量而定),-20℃保存备用。注意干燥时间不宜过长，一般20-30min，时间太长，DNA不

6、宜溶解。4．PCR引物细菌及放线菌PCR引物采用通用引物PA/PB，序列为：正向引物PA:5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’反向引物PB:5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’古菌引物：正向引物P1:5’-ATTCCGGTTGATCCTGCCGGA-3’反向引物P2:5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3’引物由Sangon公司合成。5．PCR扩增PCR反应采用热启动程序。PCR所用的10×Buffer、TaqDNA聚合酶、dNTP均购自昆明好科迪经贸有限公司。反应体系如

7、表1所列。表4-1PCR反应体系10×Buffer5.0uLdNTP4.0uLPA1.0uLPB1.0uLTaq酶0.3uLD.D.Water37.7uLDNATemplate1.0uL加石蜡油30uL6．PCR反应条件采用热启动PCR反应程序，PCR仪采用Biometra公司产品。反应条件如表2所列。表4-2PCR反应条件95℃预变性4min80℃暂停加酶95℃变性1min56℃退火1min72℃延长2min30个循环72℃延长10min4℃保存24h一般盖子的温度为99℃