细菌、真菌dna提取方法的总结

《细菌、真菌dna提取方法的总结》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、有时候提DNA不是很顺，所以提出来大家讨论一下，因为我是做微生物的，我首先提供一下关于微生物的DNA提取方法，大家觉的有可以改进的地方，欢迎讨论！！细菌DNA的提取：（一）试剂：1.抽提缓冲液2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0)25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl2.10MLiCl3.2MLiCl4.DEPC-water（抑制RNA酶活性）5.3MNaAc(pH5.2)6.96%乙醇7.70%乙醇步骤：1.抽提缓冲液65℃预热；2.加菌体到已经预热的缓冲液（700u

2、l）中混匀，65℃，10min；3.加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，离心12,000rpm，10min；4.取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，离心12,000rpm，10min；5.取上清，重复4步骤；6.加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C沉淀；11.离心12,000rpm，10min；12.弃上清，70％乙醇洗，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。(二)（我们常用的方法，但是有时有些细菌特别不好提，就用上面的方法）1.将菌株接种于液体LB培养基，37℃震

3、荡培养过夜。2.取1.5ml培养物12000rpm离心2min。3.沉淀物加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.4.加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。5.加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。6.沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．真菌DNA的提取：（一）1

4、.取真菌菌丝0.5g,在液氮中迅速研磨成粉2.加入4mL提取液，快速振荡混匀3.加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚，可以节约成本的哟！）4.1000rpm，4℃，5min5.上清用体积的氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次（10,000rpm，4℃离心5min）6.取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30min7.用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中8.加入1ul

5、RNaseA（10mg/mL），37℃处理1hr9.用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）10.取上清，1/10V3MNaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上11.沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS，3MNaAc（二）1.真菌菌丝0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉2.加入3mL65℃预热的DNA提取

6、缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次3．加入1mL5MKAc，冰浴20min4．等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）5．取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30min6．用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500LTE中7．加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1hr8．用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000rp

7、m，4℃离心5min）9．取上清，1/10V3MNaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上10．沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。