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时间:2018-01-28
《实验五.细菌总dna提取方法》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、实验五细菌总DNA提取方法100412一、实验目的:掌握细菌总DNA提取的方法二、实验原理:根据细菌DNA和蛋白质、糖类和脂类的特性的不同,分离出总DNA三、实验用品;溶液制备:母液:1)1.0MTris-HCl,称取60.57gTris(TrisAmino),溶于500mlddH2O中,用HCl调整pH8.0;2)0.5MEDTA,称取37.32gEDTA-Na,溶于100mlddH2O中,用NaOH调整pH8.0。STEbuffer(pH8.0):100mMNaCl,10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0;高压灭菌,4℃保存。TEbuffer(pH8.0):10mm
2、ol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。取5ml1mol/LTris-HCl母液,1ml0.5mol/LEDTA母液,置于400ml的ddH2O中,然后定容到500ml,高压灭菌后,4℃保存备用;四、实验步骤:1、取1ml液体培养的菌体(Gram-negativeorGram-positivebacteria),离心8000rmp2min;(肺炎克雷伯氏杆菌需离心13000rmp10min,以沉淀细胞)2、弃上清,用400ulSTEbuffer清洗两次,每次离心8000rmp2min(肺炎克雷伯氏杆菌需离心13000rmp10min,以沉淀细胞)
3、3、弃上清,加入200ulTEbuffer悬浮沉淀;4、加入100ulTris饱和酚(Tris-saturatedphenol,pH8.0);振荡器振荡60-120S,以裂解细胞;注:M.MB200振荡120S,E.coli振荡60S.5、4℃,离心13000rmp5min,以将水相(aqueousphase)从有机相(orangicphase)中分离出来;6、取160ul上层水相,转移至另一个1.5mlEp管中;7、加入40ulTEbuffer,以达到200ul体积,再与100ul氯仿(chloroform)混合,可用1ml移液抢吹打;8、4℃,离心13000rmp5min;9、用
4、氯仿抽提裂解液,直到白色的界面(whiteinterface)消失,重复2-3次;10、将160ul上层水相移入一干净的1.5ml的Ep管中;11、加入40ulTEbuffer,5ulRNase(10mg/ml),37℃保温10min;12、加入100ul氯仿,混匀,4℃,离心13000rmp5min;13、将150ul上清水相移入另一个1.5mlEp管中,-20℃保存。Refences:Hai-RongCheng,NingJiang,ExtremlyrapidextractionofDNAfrombacteriaandyeasts,BiotechnologyLetter,2006,
5、Vol.28,p55-59;Wen-pingChenandTsong-tehKuo,AsimpleandrapidmethodforthepreparationofgramnegativebacterialgenomicDNA;NucleicAcidsResearch,1993,Vol.21(9),p2260;
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