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《真菌细胞破壁方法的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、真菌细胞破壁方法的研究摘要:用4种处理对真菌细胞进行破壁，使其释放出细胞内物质•处理后的菌液用血细胞计数板计数，得到每毫升菌液中的抱子数和菌体碎片数，观察比较机械破碎的效果•以可溶性蛋白为参照,通过蛋白质的SDS-PAGE分析,比较4种处理方法使细胞破壁后释放蛋白质效果的差异•结果表明，方法2的破碎效果和细胞可溶性蛋白质释放效果都较好，是一种首选真菌细胞破壁的方法.关键词:真菌;破壁方法;可溶性蛋口；SDS-PAGEAbstract:Fourkindsofmethodforbreakingfunguscellwallswereusedtoreleaseproteinsin
2、thefungi.Thesporeandfragmentnumbersinthegermsolutiondealedwiththeabovemethodsweredeterminedwithbloodcorpusclecountingmeter.Withreleasingsolubleproteinasexample,thedifferencesofreleasingproteinsbythefourmethodsofbreakingcellwallsoffunguswereanalyzedwithSDS-PAGE.Theresultsshowedthatthesecon
3、dmethod,i.e.breakingwallwithultrasonicandaddingsilicasand,appearedwe11effectanditwasthefirstselectivemeansforbreakingcellwallofthefungi.进行细胞内含物的研究，如蛋口质、脂类、DNA和其他活性物质，都需耍使细胞壁破碎，它们才能从细胞内释放出来,所以细胞壁破碎是细胞内物质提収和研究的基本步骤⑴•真菌细胞壁较厚，结构坚韧，其破壁难度较细菌细胞大，适用于细菌细胞的破壁方法用于真菌细破壁往往效果不佳[1,2],因此我们对适用于真菌的破壁方法进行了一
4、些探索•本文采用4种处理方法对真菌细胞进行破碎，通过对处理后的菌液进行血细胞计数板计数，得到每毫升菌液中残留的抱子数和菌体碎片数，对处理真菌细胞后得到的蛋白质进行SDS-PAGE分析，比较，确定真菌细胞最佳破壁方法.1材料与方法1.1样詁制备DS-9701菌株用土豆培养液于18°C暗培养3d.其中含1mg/mlMgS04,4mg/ml,KH2PO4z2.860ug/mlH2BO3,1.015ug/mlzMnSO4和5口g/ml’Vitamin.收集菌丝置于・70°C低温冰箱屮保存备用•分别取1g菌丝加10mmol/L的磷酸缓冲液10ml•真菌细胞破碎釆用4种处理:⑴加石英
5、砂100mg,研磨15min;(2)加石英砂100mg,超声波破碎［3］;⑶加石英砂100mg,研磨2〜3min成糊状,再超声波破碎;(4)超声波破碎，不加石英砂［4］•对4种破壁方法处理后的菌液进行镜检并血细胞计数板计数，得到每毫升菌液中残留的抱子数和菌体碎片数，每一样品分别小格计数，取平均值，比较4种机械破碎效果.4种样品分别离心(15000r/min,5min);取上清液，加1倍丙酮(4°C)置于・20°C,4h・离心(15000r/min,5min);收集沉淀备用•用去离子水溶解蛋白质沉淀，加1倍体积2X上样缓冲液;2X上样缓冲液含Tris(pH6.8)100mm
6、ol、蔗糖40%SDS4%、澳酚蓝0.25%、［3■蔬基乙醇6%祥品煮沸5min,点样电泳.1.2电泳采用不连续聚丙烯酰胺凝胶系统•浓缩胶(PH6.8)和分离胶(pH8.9),质量分数分别为5.0%和13・5%・上样量为每孔5HL,以漠酚蓝为指示剂•指示剂在浓缩胶中时,电压为200V;进入分离胶后，电压增至200V.电极缓冲液均为tris■甘氨酸缓冲液(pH8・3),加质量分数为0.1%的SDS.电泳在4°C冰箱进行，停止电泳后，迅速进行固定染色⑸.1.3染色染色采用银染色法，取出凝胶在体积分数为0.01%甲醛、体积分数为50%甲醇和体积分数为12%乙酸中固定1h以上,用
7、体积分数为50%乙醇冲洗4次，每次20min;在质量分数为0.02%的硫代硫酸钠中浸泡1min左右,至胶由白色变透明;质量分数为0.2%硝酸银和体积分数为0.075%甲醛中渗透20min;在质量分数为6%无水碳酸钠、体积分数为0.05%甲醛和质量分数为0.001%的硫代硫酸钠屮显影10min;体积分数为50%甲醇和体积分数为12%乙酸终止反应.2结果与分析2.1血细胞计数板计数结果按照血细胞计数板标准使用方法进行取液和计数并进行计算,得到的每毫升菌液中残留的孑包子数和菌体碎片数结果见表1•结果显示,4种处理方法对真菌菌丝的破碎
