识别糖表位单克隆抗体的制备、鉴定和抑瘤作用

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1、分类号密级UDC编号中国科学院研究生院博士学位论文识别糖表位单克隆抗体的制备、鉴定和抑瘤作用韩伟指导教师阎锡蕴研究员中国科学院生物物理研究所申请学位级别博士学科专业名称细胞生物学论文提交日期2007年5月30日论文答辩日期2007年6月18日培养单位中国科学院生物物理研究所学位授予单位中国科学院研究生院答辩委员会主席韩伟博士论文2007摘要摘要抗体的最大特征是其识别抗原的专一性，因此在肿瘤诊断和靶向治疗中发挥重要作用。然而，获得新功能抗体的关键是发现新靶分子，这一直是抗体研究领域的热点和难点。我们利用抗体差异筛选技术，用结肠癌细胞SW

2、1116作为抗原免疫小鼠，通过正常/肿瘤组织差异筛选获得一株单克隆抗体，命名为3P9（IgM/κ）。本文主要介绍抗体3P9的制备、抗原决定簇鉴定及其抑瘤作用，获得主要结果如下：（1）免疫组化检测323例肿瘤和正常组织，发现抗体3P9特异识别腺癌组织，如结肠癌，直肠癌，乳腺癌，卵巢癌，子宫内膜癌和食道癌，不识别分泌粘蛋白的正常组织；（2）用糖生物学方法和糖芯片研究3P9抗原，发现3P9抗体识别的抗原决定族是涎酸化二糖结构（sTn）；（3）体外细胞生物学实验表明，抗体3P9对sTn阳性结肠腺癌细胞的迁移具有明显的抑制作用，并且诱导靶细胞凋

3、亡；（4）动物实验表明，抗体3P9能够抑制sTn阳性人结肠肿瘤的生长；（5）构建了3P9VH/κ小分子抗体，通过原核表达和复性，分析了小分子抗体的特异性和生物活性。以上结果表明，抗体差异筛选肿瘤靶分子的策略是可行的，而且弥补了基因和蛋白质芯片的不足，最突出的优点是：（1）捕获的抗原能够保持其天然构象，避免了重组蛋白由于构像异常而造成的假阳性；（2）不仅能够捕获蛋白质抗原，而且还可以获得非蛋白类抗原，如糖类、脂类抗原。通过这种方法获得识别糖表位的肿瘤特异抗体3P9有望应用于以下几个方面：(1)腺癌的诊断和预后监测；(2)人源化3P9抗体

4、有望用于结直肠癌的治疗；(3)由于糖抗原免疫原性较低，研制抗3P9独特型抗体可作为sTn的内影像结构疫苗；(4)作为一种新的研究工具应用于肿瘤糖生物学研究。在2003年刚进入实验室时，正值为遏制SARS重临寻找对应措施和加紧研制抗SARS药物和疫苗的关键阶段，作者参与了SARS的专项研究工作。主要贡献如下：(1)从四例SARS恢复期患者的外周血分离淋巴细胞，构建针对SARS病毒的6噬箘体人抗体库。库容量为1.83×10。通过免疫亲和筛选，获得两株特异识别SARS病毒的单链抗体，H12和B1。尽管这两株抗体都具有病毒中和作用，但它们识别

5、的表位不同。通过抗原表位鉴定，我们发现单链抗体B1识别SARS病毒S2（1023-1189），为线性表位（BiochemBiophysResCommun.2005Jul22;333:186-93）;而单链抗体H12识别S1（12-672）二聚体，为构象依赖型表位（AntivirTher.2006;11:117-23）。(2)研究了光触媒钛网膜（PTAF）对SARS病毒的灭活作用，发现光触媒钛网膜能有效杀灭SARS活病毒，比普通羟基磷灰I韩伟博士论文2007摘要石网膜（HAT）的杀病毒作用强1000倍（生物学与生物物理进展,2004，3

6、1:982－985）。关键词：单克隆抗体3P9，糖链抗原sTn,，肿瘤生长抑制，噬菌体抗体库SARS冠状病毒II韩伟博士论文2007AbstractAbstractHanWei(cellbiology)DirectedbyYanXiyunInthepastdecades,monoclonalantibodies(mAb)andantibodyengineeringhaveplayedmoreandmoreimportantrolesinoncologicalstudy,aspowerfultoolsincancerdiagnosisa

7、ndtargettherapy.However,themajorlimitationfordevelopingfunctionalantibodiesisattributedtothedifficultyofdiscoveringnoveltargetmoleculeincancer.Inthisstudy,differentialscreeningtechniquewasengagedinsolvingtheproblem.Bymeasuringthespecificbindingaffinitytotumorbutnotnorma

8、ltissue,wescreenedoutanovelmonoclonalantibody,named3P9,fromhundredsofantibodies,whichweregeneratedbyimmunizing