乙型脑炎病毒ns1蛋白单克隆抗体制备与其表位的鉴定

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1、摘要流行性乙型脑炎(Japaneseencephalitis，JE)是由黄病毒科黄病毒属的乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)引起的一种以蚊虫为媒介传播的人和动物共患的病毒性疾病．乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)与西尼罗病毒(WestNilevirus，WNV)、圣路易脑炎病毒(Saint．Louisencephalitisvirus，SLEV)和墨累河谷脑炎病毒(MurrayValleyencephalitisvirus，M

2、VEV)同属一个血清群。上述病原可导致严重的公共卫生问题，而且其中的两种或多种病原往往在同一地区流行，加之它们在血清学上存在严重的交叉反应，所以建立起针对上述病原的快速、可靠的鉴别诊断方法十分必要。本研究以本实验室保存的SAl4．14．2株NSl基因进行密码子优化后，由人工合成，将NSl基因分别亚克隆至原核表达载体pET-30和pMAL．e5X构建出重组质粒pET-30．opti．NSl和pc5X．opti．NSl。将pET-30．opti．NSl重组质粒验证连接正确后转化大肠杆菌感受态细胞BL21，经I

3、PTG诱导表达后，将表达产物纯化作为免疫原，免疫6周龄BALB／c小鼠；经过免疫、融合、筛选等过程，共获得16株特异性针对NSl蛋白的单克隆抗体，IFA表明其中8株能识别天然状态下的NSl蛋白；将pc5X．opti．NSl重组质粒验证连接正确后转化大肠杆菌感受态细胞ER2523，经IPTG诱导表达后，SDS．PAGE分析结果显示重组的NSl蛋白在原核表达系统中得到大量表达，并部分以可溶形式存在。Westernblot和间接ELISA检测表明该重组NSl蛋白能与猪JEV阳性血清发生特异性反应。以pc5X．o

4、pti-NSl表达的MBP—NSl蛋白为检测用抗原，建立间接ELISA检测方法筛选分泌NSl蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。设计一套包含整个NSl蛋白的51个短肽片段，每个肽段长度为16aa，每两个相邻的短肽之间有8aa的重叠。为表达这些短肽，首先人工合成了表达它们的基因，在编码链的5’端引入BamHI位点，3’端引入XhoI位点。这51个肽段经IPTG诱导后得到了表达，表达产物与制备的单克隆抗体100816．10F7、100816．885、100910．1E8、100816．7G1、100816．4E3、1

5、00910．6D8作用，ELISA结果与单抗100816．10F7、100816．885、100910．1E8、100816．7Gl、100816-4E3、100910．6D8呈现明显的阳性反应，由此可以判定单抗的抗原表位，分别将该区域逐一氨基酸截短表达后与对应单抗反应，结果表明5AIDITRKll、72RDELNVL78、227ETHTL，W232、251KSKHNRREGY260、269DENGIVLD276、341DETTLVRS348序列为该表位的核心序列。关键词：乙型脑炎病毒；NSl蛋白；单克隆

6、抗体；表位]PreparationofMonoclonalAntibodiesagainstNS1ProteinofJapaneseencephalitisvirusandIdentificationofB—cellEpitopesMastercandidate：LikeLiuAdvisor：Prof．YuhongRenProf．RonghongHuaMajor：BasicVeterinaryMedicineAbstractJapaneseencephalitisvirus(JEV)，beingamemb

7、erofthefamilyFlaviviridae，iSusuallyinfectedtothehumanbodyandanimalthroughmosquitoesandthenmaycauseacuteviralencephaliticandneurologicdisease．TheJapaneseencephalitisvirusserocomplexofthefamilyFlaviviridaeincludesWestNilevirus(WNV)，SaintLouisencephalitisvir

8、us(SLEV)andMurrayValleyencephalitisvirus(MVEV)．Theseviruseshaveasimilarecology,itisverycommonthattwoormoreoftheseflavivirusesco。circulateinsomeregionsoftheworld，theinitialsymptomsofmostoftheseviralinfectionsaresimil