流行性乙型脑炎病毒e蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

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1、流行性乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体的制备及鉴定摘要流行性乙型脑炎简称乙脑，是由黄病毒科黄病毒属的乙脑病毒(也称日本脑炎病毒，Japaneseencephalitisvirus，／EV)引起、由蚊虫传播的一种急性病毒性传染病，主要侵害中枢神经系统，对人类健康威胁很大。对猪可引起繁殖障碍，给养猪业造成巨大的经济损失。猪是／EV的中间宿主，带毒猪是本病的主要传染源。因此，控制猪的JE不仅对养猪业而且对人类健康都具有十分重要的意义。E蛋白是／EV的主要结构蛋白，在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。本研究首先利用原核表达

2、的乙型脑炎病毒SAl4一14．2株结构蛋白E蛋白作为免疫原，免疫6周龄BALB／c小鼠，采用淋巴细胞杂交瘤技术进行融合，经有限稀释法共获得15株特异性针对JEVE蛋白的杂交瘤细胞，分别命名为1A9、1G12、lH2、2A6、283、2G3、3D1、4E6、4H1、583、587、5D4、5D7、5Gll、5G12，经测定587单抗亚类属于IgG2b，5D4和5G12的单抗亚类属于IgG2a,其余12株均为IgGl，轻链均为1c链。经Westernblot证实所得杂交瘤细胞分泌的抗体均可特异地与JEVE蛋白反应。结果表明，所制备的抗重组JEVE蛋白的单抗对

3、病原检测具有很高的特异性，为JEV准确快速的病原诊断和JEV感染相关的基础性研究提供了物质基础。由于鼠源性单抗在治疗时引起了严重的HAMA(humananti．mouseantibody)反应，限制了临床的运用，为了克服鼠源MAb的免疫源性，使之和人体分子有非常相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，降低或避免诱导HAMA反应。采用基因工程方法制备单链抗体免除了杂交瘤技术繁杂的筛选过程，拓宽了抗体的应用范围，大大推进了抗体工程的进展。本试验从分泌抗乙脑病毒E蛋白特异性单抗的杂交瘤细胞株5D4中提取总RNA，利用RT-PCR技术克隆抗乙脑病毒E蛋白单抗5D4

4、VH基因，并将其插A．pMDl8．T载体中进行测序分析。Ⅶ基因全长328bp。通过分析，这些基因均符合小鼠IgGV区基因的特征，含有4个框架区、3个抗原互补决定区，而且抗体特征性的半胱氨酸残基的数量和位置也正确。为下一步构建多种形式的基因工程抗体奠定了良好的基础。关键词：乙型脑炎病毒；E蛋白；单克隆抗体；基因克隆；序列测定IIIProductionandcharacterizationofthemonoclonalantibodiesgainstEnvelopeproteinofJa[EncephalitisVirusagainstEnvelopepro

5、teinofJapaneseEncephalitisVirusAbstractJapaneseencephalitisvirus(JEV)，beingamemberofthefamilyFlaviviridae，isusuallyinfectedtothehumanbodyandanimalthroughmosquitoesandthenmaycauseacuteviralencephaliticandneurologicdisease．Therefore，itiscommonlyregardedasaseriouspublichealthproblem

6、，withJEVbeingtheinfectiousagentinmanydomesticandwildanimals，especiallywithswine(viralassociatedabortions)．SwineisconsideredthemainvertebratehostandrepresentsanimportantamplifierandreservoirforJEV．ThereforepreventionofJEinswineCallbenefitforswineproductionandhealthofhumanbeing．Hen

7、ce，itisessentialtopreventswineJE，whichisusefulforswineproductionaswellashealthofhumanbeing．Theenvelopeglycoprotein,amajorstructuralantigen，isassociatedwithviralattachment,fusion,hemagglutination,cellulartropism，viralvirulence，andinductionofprotectiveimmuneresponse．Inthisstudy,Fif

8、teenspecificitymonoelonalantibodies(McAb