交链孢菌植物激活蛋白的提取鉴定及活性检测1

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1、交链孢菌植物激活蛋白的提取鉴定及活性检测摘要：本文采用菌丝体回收，破碎离心等处理提取交链孢菌的粗蛋白，通过多次优化SDS-PAGE电泳方法对粗蛋白进行分离鉴定，获得了分子量约为42kD的植物激活蛋白。并对该蛋白的活性进行了初步的检测和研究。实验表明：经激活蛋白粗提液处理后，提高了小麦种子发芽率，尤其在浸种6h浓度为3μg/mL时效果最好。关键词：交链孢菌；植物激活蛋白;鉴定;活性检测作者简介：程彦伟(1975一)，男，博士，副教授，主要从事微生物学方面研究。E-mail:cywztg@126.com。基金项目：本课题受到河南省科技攻关计划项目（102102110155，112102

2、310524，112102310524）和洛阳师范学院应用科学与技术研究基金项目（10000993）支持。植物激活蛋白是从葡萄孢菌（Botrytis）、交链孢菌（Alternaria）、黄曲霉菌（Asporgillus）、稻瘟菌（Pyrcularia）、青霉菌（Penicillium）、纹枯病菌（Rhizoctoniasolani）、木霉菌（Trichoderma）、镰刀菌（Fusarium）等多种植物病原真菌中筛选、分离、纯化出的一种新型蛋白质[1]，氨基酸序列保守，与蛋白质数据库中已知的蛋白序列均无同源性，属于一种全新的蛋白质。中国农科院环境与发展研究所蛋白质药物工程实验室对其

3、作用机理进行了初步研究，推测其机理可能为：来源于真菌的42～65KD的一类信号传导分子，可通过不同的代谢途径实现信号传导，引起基因表达，激活植物自身防御系统和生长系统，提高植物自身免疫力，通过调节植物生长代谢系统，促进植物生长，提高作物产量和产品品质[2]。邱德文博士根据其作用机理将此蛋白命名为植物激活蛋白（Plantactivatorprotein），并在我国注册了专利[3]。该蛋白为一种具有蛋白激发子功能的新型蛋白质农药[4]，可诱导多种植物产生系统抗性，促进植物生长，改善作物品质。其对植物烟草花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病等多种病毒病害和蚜虫的防效在75%以上，并能促生增产[5]

4、。激活蛋白诱导处理黄瓜种子能够加快种子的萌发，促进幼根的生长；处理多种瓜果蔬菜均能提高其座果率，如处理西瓜和番茄可使瓜果数和果重显著提高，分别达到77.4%和45.7%(湖南宏利农业科技有限公司)；对灰霉病害的防效达76.92%(湖南农业大学植保学院提供)；诱导植株抗青枯病的防治效果达70.97%(文章待发表)；5长沙普绿通生物科技有限公司用激活蛋白可湿性粉剂处理桃子与西红柿，可减少桃子与西红柿灰霉病的发病率和烂果率，对桃子与西红柿具有保鲜作用[6]。由此可见植物激活蛋白具有广泛的应用前景。由于植物激活蛋白是一种性能稳定易于规模化生产的新型微生物蛋白，是一种广谱高效多功能生物农药[

5、7]。该蛋白制剂本身无毒，不改变植物的基因组，同时也不会改变生态系统物种的种群结构，不引起病原物和害虫的抗药性，在植物体内和土壤中易分解，无残留[8]，可大幅度提高农产品质量和国际竟争力，是一种新型的环保产品。因此该种微生物蛋白农药的研究正逐步成为生物农药发展的一个重要内容，对该蛋白的研究具有重要的意义。本论文以交链孢菌为材料，提取其蛋白粗提液，通过实验优化，探索并建立一套适合本实验室的植物激活蛋白的鉴定方法，并对得到的蛋白质进行生物活性检测和初步探究，为人们进一步对植物激活蛋白的提取鉴定研究提供了条件和方向；为进一步研究植物激活蛋白的活性检测、作用机制、序列测定以及蛋白质结晶和基

6、因克隆打下基础，对于构建工程菌株和转基因植物研究具有重要的意义。1材料与方法1.1实验材料交链孢菌(Alternarialongipes)2010年7月从小麦田地土壤中分离，小麦种子由郑州大学河南离子束重点实验室提供。1.2实验仪器超净工作台、培养箱、离心机、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳仪、电子分析天平、85-Ι恒温磁力搅拌器、水浴锅、紫外-可见分光光度仪、抽滤机、各种型号移液枪、培养皿、离心管等仪器1.3实验试剂丙烯酰胺(Acr)、N,N-双亚甲基丙烯酰胺(Bis)、考马斯亮蓝G-250、甘氨酸为Sigma公司产品、N,N,N'N'一四甲基乙二胺((TEMED)为Fluca公司产品

7、、溴百里酚蓝(BTB)、氯化钠、氯化钾、十二烷基苯磺酸钠(SDS)、Tris碱、蔗糖、过硫酸铵、巯基乙醇、冰乙酸、甲醇，蒸馏水等试剂1.4实验方法1.4.1交链孢菌菌株的培养及粗蛋白的提取(1)接种在超净工作台上，挑取适量斜面菌株的营养菌丝体接种于己灭菌含有5液体马铃薯培养基(PDA)的三角瓶中。(2)发酵将已接种的三角瓶置于控温摇床，30℃，200rpm，摇菌72小时。(3)菌丝体回收用抽滤法将培养好的发酵液抽去而获得菌丝营养体，用磷酸缓冲液清洗2～3次。(4)破碎