斑污拟盘多毛孢菌激活蛋白的分离纯化及其生物活性的研究.pdf

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1、万方数据Separation，PurificationandBiologicalActivityResearchofActivatorProteinfromPestalotiopsismaculans(Cda．)NagRajbyZhangBoyang(MasterofForestry)DirectedbyProfessorHanShanYa’an，Sichuan,ChinaJune，2014万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也

2、不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：则镌阳czoI悔稠l／日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。晦论文不保密。口本论文保密，在一年解密后适用本授权。(请在以上口内划“√’’)研究生签名：导师签名：尕掳西q锵aof争年厂

3、月ff日aD／伞年占月f／日万方数据摘要激活蛋白(Activatorprotein)是从多种病原真菌中分离的具有诱导植物抗病性、增强抗逆能力、促进植物生长等生物活性的一类新型蛋白激发子。激活蛋白能显著增强植株对多种重要植物病原体的系统广谱抗性，且其诱抗效力强。目前对斑污拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsismaculans(Cda．)NagRaj)菌丝体内胞内可溶性激活蛋白的研究尚未见报道。本研究以斑污拟盘多毛孢菌为实验材料，通过硫酸铵分级分段沉淀结合凝胶过滤层析，从斑污拟盘多毛孢菌菌丝体中分离纯化获得分子量17．7kDa有激活生物活性的蛋白。生物活性测定表明，该蛋白可显著提高玉米、白菜

4、、黄瓜、豌豆种子的发芽率和根长生长，并可促进豌豆、玉米幼苗植株生长，提高豌豆、玉米幼苗叶片叶绿素含量，提高豌豆、玉米幼苗的根冠比和根系活力。本研究获得了以下研究成果：1．通过用滤液和蛋白粗提液处理玉米、白菜、黄瓜、豌豆种子，发现斑污拟盘多毛孢菌能够产生可以促进一些种子萌发和根长生长的有激活生物活性的成分，并且此激活成分存在于蛋白粗提液中。本研究采用硫酸铵分级沉淀法对蛋白粗提液进行盐析，然后对硫酸铵沉淀所得上清液和沉淀进行生测，生测结果显示上清液没有活性，沉淀有活性，证明活性物质存在于沉淀中，说明有激活活性的物质可能属于大分子类蛋白质，可能是斑污拟盘多毛孢菌菌丝体组成组分的胞内可溶性蛋白，从而

5、为进一步分离纯化奠定基础。2．由实验可知激活蛋白存在于斑污拟盘多毛孢菌菌丝体内，为了在最短的时间内尽可能地获取最多的菌丝，本研究从接种量、培养时间、温度、溶氧量、摇床转速、pH六个因素对斑污拟盘多毛孢菌在振荡培养条件下产菌丝量进行优化选择。以上六个培养条件分别达到最优，组合起来即为最佳振荡培养条件。实验得到温度25℃，pH为6，三个菌饼接种到200mL培养液振荡培养lld，这样的培养方案菌丝产量最大且最经济。3．采用硫酸铵分级分段沉淀法对斑污拟盘多毛孢菌蛋白粗提液进行盐析，得到其盐析的最适饱和度为60％。此粗提物经SephadexG．75凝胶细柱子层析后得到两个峰，其中峰2为活性峰。将峰2集

6、中收集浓缩再过SephadexG．75凝胶粗柱子层析后获得7个峰，其中峰2．7经检测有活性，SDS．PAGE电泳检测该峰为单一条带，以相对迁万方数据移率(mR)算得该蛋白的分子量为17．7kDa。4．研究纯化蛋白的生物活性，研究其处理种子后对豌豆、玉米的发芽率，根长生长，植株生长，叶绿素含量，根冠比，根系活力的影响。斑污拟盘多毛孢菌激活蛋白纯化样品处理豌豆、玉米种子后使豌豆、玉米种子的发芽率分别提高了8．84％、8．17％，根长分别提高了33．20％、39．75％，以及豌豆、玉米幼苗的株高提高了18．06％、26．33％，叶绿素含量分别提高了21．22％、18．21％，根冠比分别提高了84．

7、62％、21．74％，根系活力分别提高了28．57％、66．67％，促进了植株生长。关键词：斑污拟盘多毛孢菌；激活蛋白；分离纯化万方数据AbstractActivatorproteinisakindofnewtypeofproteinwithelicitorfunction，whichisseparatedfromplantpathogenicfungi，whichCaninducemanykindsofpl