细交链孢菌酮酸酶联免疫吸附分析方法研究.pdf

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1、第40卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第9期20l2年9月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl3471352细交链孢茵酮酸酶联免疫吸附分析方法研究杨星星刘细霞王弘徐振林沈玉栋孙远明(广东省食品质量安全重点实验室，华南农业大学食品学院，广州510642)摘要采用水合肼和乙醛酸依次对细交链孢菌酬酸(Tenuazonicacid，TeA)进行衍生化，设计合成了含有氮杂共轭双键偶联手臂，可增强免疫效果的半抗原TeAHGA。通过偶联载体蛋白BSA后的免疫原TeAH

2、GA—BSA免疫新西兰大白兔，成功制备了特异性识别TeA水合肼衍生物TeAH的多克隆抗体；优化确立了ELISA最佳反应条件(TeAH—OVA为异源包被原、包被浓度0．156~tg／L、药物稀释及反应缓冲液为PBS、一抗反应时间40min、二抗反应时间20min)，建立了TeA间接竞争ELISA(icELISA)检测方法，其抑制中浓度(IC。)为1．61pg／L，检出限(LOD)为O．08pg／L，定量线性检测范围为0．19～12．89g／L(IC。～IC。)。番茄、面粉样品平均添加回收率分别为67．2

3、％～89．8％和74．8％～93．7％。关键词细交链孢菌酮酸；异源包被；半抗原；多克隆抗体；免疫分析引言细交链孢菌酮酸(Tenuazonicacid，TeA)是由链格孢菌、稻瘟病菌等产生的一种毒性代谢物，是毒性最高的链格孢菌毒素]，长期食用累积可引起慢性中毒，导致哺乳动物胃肠道大面积出血及循环衰竭以至死亡等。链格孢菌对环境的适应力强，广泛存在于谷物、蔬菜、水果以及田问作物，是污染农业食品、饲料等最普遍的真菌之一_2l，其毒性代谢物TeA已在世界各地的番茄、小麦、葵花籽等农业食品巾均频繁检。Azcara

4、te等连续两年对阿根廷小麦抽检，发现阳性样品中TeA的平均含量为2_313mg&g；DaMotta等对巴西市售的l1个品牌的番茄产品进行TeA检测，检率为13．75％，含量为29～111mg&g；Siegel等对德国43种不同方式酿造的啤酒进行了检测，其中37种检测TeA为阳性，最高的含量为(175±13)g／l(g。Li等同对我国北京郊区小麦检测发现所有样品中均含有TeA，平均含量为2．4mg&g，最高含量为6．4mg&g。可见，农业食品中TeA污染的普遍性已对食品安全带来隐患。目前检测TeA主要采

5、用气相色谱法(GC)、液相色谱法(HPLC)、液相色谱法质谱法(HPLC—MS)及同位素薄弱化分析(SIDA)等]。仪器分析法的灵敏度和准确度高，但前处理繁琐，检测成本高，难以满足现场的、大批量样品的快速检测；而且，南于TeA在化学性质上表现为强酸性，且易与金属发生螯合，已建立的仪器检测方法均存在一定缺陷]。近年来，免疫检测方法以其特异性强、快速、灵敏等优点，已成为农业、医药和食品安全检测领域研究的热点之一『1。。1，其中酶联免疫吸附分析法(ELISA)研究应用最为广泛，然而，有关TeA的免疫检测研究

6、尚未见报道。因此，本研究通过合成具有半刚性氮杂共轭双键结构间隔臂的TeA半抗原，制备特异性TeA衍生物TeAH的多克隆抗体，建立以TeAH为靶标物的TeA间接检测icELISA方法，为进一步开发快速、简便的TeA毒素ELISA检测产品奠定基础。2实验部分2．1仪器与试剂DRX-400／600核磁共振仪(德国Burker公司)；HP1100液相色谱一质谱联用仪(美国Agilent公司)；UV一160A紫外一可见扫描仪(日本Kyoto公司)；MultiskanMK3酶标仪(美国Thermo公司)；Well

7、washMK2洗板机(美同Thermo公司)；6K_15高速冷冻离心机(德国Sartorius公司)。Freund氏完全佐剂与不完全佐剂(Sigma公司)；N，N一二甲基甲酰胺(DMF)；N一羟基琥珀酰亚胺201卜11O5收稿；2012—02—20接受本文系吲家Ff然科学基金(Nos．30871755，30901005)资助项目E—mail：gzwhongd@163com；syd—tyx@163．tom1348分析化学第40卷(NHS)；二环已基碳二亚胺(DCC)；牛血清蛋白(Bovineseruma

8、lbumin，BSA)；卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)；HRP水合肼；乙醛酸(上海阿拉丁试剂有限公司)；标记的羊抗小鼠IgG抗体(武汉博士德生物T程有限公司)；番茄、面粉(购于农贸市场)。2．2实验方法2．2．1TeA的合成采用文献【13]的方法合成得5．3g棕红色油状TeA，产率54％。HNMR(600MHz，DMSO，TMS)：0．95(t，J一6．6Hz，3H，CH3)，0．97(d，J一6．6Hz，3H，CH3)，1．45(m，2H，CH