极细链格孢菌功能基因his3及leu2的初步研究

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1、捅要极细链格孢菌(Alternariatenuissima)是一种植物病原真菌，对农业生产危害巨大，然而其在生防、环保等方面也有应用，因此从分子水平研究该菌的功能基因的调控机制，对进一步开发利用该菌具有重要意义。在真核微生物的遗传学研究中LEU2和HIS3基因是重要的营养标记，通过遗传学手段，我们筛选获得了极细链格孢菌AtLEU22量．AtHIS3基因，并且研究了AtLEU2’)及-AtHIS3基因互补酿酒酵母的功能。以(3418抗性基因作为选择标记，构建了用于敲除极细链格孢菌彳圮E叩励tHIS3基因的质粒，建立了极细链格孢菌的遗传转化系统，为进一步研

2、御圮E沈黝tHIS3基因的功能奠定了坚实的基础，主要研究结果如下：1、将极细链格孢菌eDNA表达文库转化到酵母LEU2缺失突变株，用SD．LEU培养基进行筛选，获得了3个正常生长的酵母转化子。对转化子质粒进行测序分析，发现这些基因编码的蛋白质序列均与酵母LEU2(&皿沈)基因编码的363个氨基酸同源(命名为AtLEU2，其编码的蛋白质命名为Atleu2p)，该基因编码的蛋白与植物病原菌小麦颖枯病CAB72262；灰葡萄孢霉EDN21270；玉蜀黍赤XP一386851，以及水稻稻瘟病病菌XP367617所编码的p．苹果酸脱氢酶同源，相似性分别达到94％、

3、74％、1％和69％，与酿酒酵母、粗糙链孢霉EAA33847相似性为70％和63％。2、将极细链格孢菌eDNA表达文库转化到酵母HIS3缺失突变株，在SD．HIS培养基上筛选，获得了2个正常生长的转化子。所得基因的开放阅读框(ORF)含有717个碱基，编码238个氨基酸，与酵母HIS3(ScHIS3)基因同源(命名为AtHIS3，其编码的蛋白质命名为AtHis3p)，AtHis3p与植物病原真菌链格孢BAF69039，小麦颖枯病EAT83561，灰葡萄孢霉EDN23196，玉蜀黍赤霉XP386269，以及水稻稻瘟病病菌XP367617中编码的咪唑甘油磷

4、酸脱水酶同源，相似性分别达到100％，90％，68％，65％和63％；与生防菌哈茨木霉P34041相似性达64％；与酿酒酵母，粗糙链孢霉XP961386编码的蛋白相似性达64％和66％。3、分别选择以AtLEU2及AtHIS3基因上下游同源序列500bp左右作为同源臂，在上游同源序列3’端连接G418抗性基因(以保证缺失突变株的检测及鉴定)，构建了用于敲除极细链格孢菌AtLEU2及AtHIS3基因的质粒，为在极细链格孢菌中敲除AtLEU2及AtHIS3基因奠定了坚实的基础，为进一步研究链格孢菌AtLEU2及AtHIS3基因的功能及作用机理提供了重要的试

5、验材料。4、基于极绷链格孢蘸在含有G418(100l-tg／mL)的PDA培养基上不能生长的药物敏感性实验结果，建立了用G418抗性基因作为选择标记的遗传转化系统，从而为研究极细链格孢菌功能基因的敲除、缺失突变株鉴定提供了可靠的筛选标记，并为后续研究打下必要的基础。关键词：极细链格孢菌，eDNA表达文库，AtLEU2基因，AtHIS3基因，原生质体转化ⅡIdentif!icationandPremilinaryStudyofHIS3andLEU2genesofthefungusAlternariatenuissimaW撕Ying(PlantPathol

6、ogy,SichuanAgriculturalUniversity)DirectedbyHuangYunandJingLing-huoAbstractAlternariatenuissimaisaplantpathogenicfungi，ithasenormousharminagriculture，butalsousedinbiologicalcontrol，environmentalprotection,andSOon．ItisimportanttostudytheregulatorymechanismoffunctionalgeneinAltern

7、ariatenuissima．InEukaryotiemicroorganisms，LEU2andHIS3genesisallimportantmarkerofnutrition．Inthisstudy，wescreenedtheAlternariatenuissimaeDNAexpressionlibraryinauxotrophyeast,andidentifiedandcharacterizedtheA．tenuissimaAtLEU2andAtHIS3genes．ArecombinantvectorsforknockingoutAtLEU2an

8、dAtHIS3geneswasconstructed，andinsertedtheG418re