ES细胞的诱导与应用

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1、ES细胞的诱导与应用本次课的主要内容ES细胞的定义，及其研究发展史。ES细胞的分离培养和生理特性。ES细胞的自我更新，诱导分化。ES细胞的应用前景和所面临的挑战。一、什么是ES细胞一般来讲，ES细胞是指从早期的囊胚中的内细胞团（innercellmass,ICM)分离得到的具有无限增殖能力和多分化潜能的一类干细胞。两个重要特性：（1）多潜能性分化，可分化成三胚层以内的所有细胞。（2）可无限的保持未分化状态，扩增传代。有关干细胞的概念一、定义：具有自我复制的能力，在一定条件下能够分化成各种功能细胞。二、分类：(1)全能干细胞：具有全能性，

2、可以分化成全身200多种细胞类型，进一步形成机体的任何组织和器官，该类细胞包括，胚胎干细胞（embryonicstemcells)和生殖干细胞（embryonicgermcells).(2)多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力。(3)转能干细胞：只能向一种或密切相关的两种细胞类型的细胞分化。二、胚胎干细胞研究的进展情况：1981年，Evans和Martin分别成功的分离和体外培养了小鼠的胚胎干细胞。1995年，Thomson等人分离建立了第一株灵长类动物的胚胎干细胞。1998年，Thomson等建立

3、了第一株人类胚胎干细胞。1998年，Shamblott等建立了第一株人类生殖干细胞。2006年，Yamanaka建立诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcell,IPS）胚胎干细胞系的建立过程分离囊胚的内细胞群IPS与成纤维细胞共培养，ES细胞非分化增殖分离胚胎生殖腺脊细胞------胚胎干细胞的鉴定------定向诱导分化-------成体干细胞-----功能细胞ES细胞培养过程利用体细胞核移植技术获取ESCES与EG细胞ES细胞培养过程小鼠胚胎成纤维细胞的处理方法：1、γ-射线照射法。2、丝裂霉素处理

4、法。目的：使得作为饲养层的成纤维细胞停止分裂，但又不至于马上死亡，在体外维持一段时间生命，为ES细胞提供维持其生长和未分化状态的诸多细胞因子。IPS三、ES细胞的细胞特性1、细胞形态：与早期胚胎细胞相似的形态结构特征，胞体体积小，核大，有一个或多个核仁，核仁清晰，多为常染色质，胞质结构简单，散布大量核糖体和线粒体。核型正常，具有稳定的整倍体核型。三、ES细胞的细胞特性2、生长特性：ES细胞在体外分化抑制培养时，呈克隆状生长，细胞紧密的聚集在一起，圆形或卵圆形，细胞均呈单层或多层紧密堆积，形成岛状或巢状的群体细胞克隆，细胞之间的界限不清，

5、克隆周围可见单个ESC和分化的扁平状上皮细胞。四、ES细胞的分子生物学标志1、碱性磷酸酶（AKP）ES细胞含有丰富的碱性磷酸酶，活性高。但在已经分化的ES细胞中碱性磷酸酶则呈弱阳性或阴性，因此常作为ES细胞鉴别和区分ES细胞分化与否的重要标志之一。2、端粒酶ES细胞表现出高水平的端粒酶活性，不同于正常的二倍体细胞，可能是其复制生命期限远比体细胞长的原因。研究发现，端粒酶的减少是细胞衰老的重要机制之一，但在ES细胞、生殖细胞和肿瘤细胞中，端粒酶呈高水平表达，具有高活性，在细胞每次分裂之后，可保持端粒长度，进而维持细胞的长期存活。四、ES细

6、胞的分子生物学标志3、胚胎阶段特异性表面抗原（SSEA）SSEA是一种糖蛋白，常表达于胚胎发育早期的细胞，ES细胞中SSEA表达阳性，可作为ES细胞的标记分子之一，用于鉴别。然而，不同种属的动物，其表面抗原组成并不完全一致。五、ES细胞的诱导分化当鉴别一株细胞是不是ES细胞时，除了要经过以上的检测：形态和生长特性，染色体核型分析，特异性表面抗原等。更重要的是要看其是否具有多分化潜能。ESC的诱导分化一般可分为：（1）体外诱导分化（2）定向诱导分化（3）体内分化五、ES细胞的诱导分化干细胞诱导分化的常用方法：（1）加入诱导细胞分化的因子或

7、化学物质，如VGEF、bFGF、DMSO和RA等。（2）将ES细胞与特定的细胞共培养。（3）将某种分化诱导因子的基因转入ES细胞内。五、ES细胞的诱导分化（1）体外诱导分化：其又可分为两种：去除抑制因子的细胞单层培养法。将ESC消化后不贴壁的悬浮或悬滴培养法：可形成EB，其在体外可诱导分化成各类细胞。常用的诱导剂：维甲酸（RA）、二甲基亚砜（DMSO）和环六甲基双乙胺（HMBA）等。五、ES细胞的诱导分化（1）定向诱导分化：即是将ES细胞定向向某一种类型的细胞分化，如向上皮细胞或成纤维细胞方向等。其成功与否，受到基因表达调控方面不同诱导

8、调节因子、靶细胞状态及局部微环境等多因素的影响。其实质是细胞特异性基因在时间和空间上差次表达的结果，这种细胞间差异主要取决于哪些基因被激活和在什么时间与位点被激活。五、ES细胞的诱导分化（1）定向诱导分化：