神经浸出液诱导脂肪干细胞向雪旺细胞分化的研究与应用

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1、分类号UDC密级编号专业硕士学位论文神经浸出液诱导脂肪干细胞向雪旺细胞分化的研究与应用TheresearchandapplicationforSchwann-likecelldifferentiationofadiposederivedstemcellsinducedbyneuralleachate学位申请人：张春燕指导教师：邓雯教授合作教师：刘玉梅副教授专业领域：兽医学位类别：兽医硕士2015年05月独创性声明本人声明，所呈交的论文是我个人在导师指导下完成的研究工作及取得的研究成果。据我所知，文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写

2、过的研究成果，也不包含为获得河南科技大学或其它教育机构的其他学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：日期：I摘要摘要周围神经损伤在临床中比较常见，由于成熟的神经元不能分裂增殖，因此，外周神经损伤后的修复效果很不理想。随着组织工程学的发展，人们用组织工程神经代替自体神经修复外周神经损伤并取得了较好效果。组织工程神经的构建主要包含种子细胞、支架材料和神经营养因子三个方面，其中理想的种子细胞是构建人工神经的前提和基础。雪旺细胞（Schwanncells，SCs）在神经再生中起重要作用，

3、是修复神经损伤理想的种子细胞。但是SCs体外培养困难，增殖速度慢，且培养过程中容易受到成纤维细胞污染，不能满足神经修复的要求。脂肪源性干细胞（Adiposestemcells，ADSCs）是具备多向分化潜能的干细胞，在特定环境下可以向SCs分化，同时，ADSCs还具有来源广泛、取材简便、并发症少、增殖速度快、扩增稳定等优点，因此可以成为组织工程神经理想的种子细胞来源。然而目前常用的诱导ADSCs向SCs分化的方法都存在一定的弊端。本研究应用共培养原理，利用外周神经分泌的神经营养因子来诱导ADSCs向SCs分化，以期简化操作程序，节约诱导成本，为解决临床上修

4、复外周神经损伤过程中的种子细胞难题提供新思路，整个实验分为五个部分。1.大鼠ADSCs的体外分离培养和鉴定无菌条件下取出3周龄SD大鼠两侧腹股沟脂肪，采用Ⅰ型胶原酶消化法获得单细胞悬液，并培养在含10%FBS的DMEM培养基中。通过骨向和脂向分化以及流式细胞仪检测细胞表面Marker对所培养的细胞进行鉴定。结果显示成骨诱导后ADSCs形成典型的黑色钙结节，茜素红染色呈现红色；成脂诱导后逐渐出现脂滴，油红O染色为红色。流式检测结果显示：CD44和CD90呈阳性表达，CD31和CD45呈阴性。以上结果证实，分离到的细胞为ADSCs。2.ADSCs体外特性研究本

5、部分的目的是掌握ADSCs的体外分化特性，为选择合适的传代次数和适宜的接种密度提供理论基础。将ADSCs培养至12代，然后诱导第3、6、9和12代的ADSCs向成骨和成脂分化，并通过茜素红和油红O染色对诱导结果进5232行检测。同时选取第3代ADSCs用两种不同的密度（5×10/cm和1×10/cm）进行接种，再用Western-blot检测第3、6、9、12代以及两种不同传代密度的ADSCs的BMP-2的表达，并检测第1-12代ADSCs的碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase，ALP）活性。结果证实，第3、6、9、12代的ADSCs均可被诱

6、导成骨细胞和脂肪细胞，但随着传代次数的增加，ADSCs成脂分化潜能逐渐降32低，成骨能力未见明显差异。第12代以及以1×10/cm密度培养的ADSCs的1摘要BMP-2呈阳性表达；随着传代次数的增加，第1-12代的ADSCsALP活性逐步3252增加，1×10/cm密度培养的ADSCs的ALP活性较5×10/cm接种的ALP活性显著增加。ADSCs在体外连续传代或者以较低密度接种时可导致衰老并自发分52化成骨。因此ADSCs的体外研究应选择3-5代，并以5×10/cm的密度进行传代较为适宜。3.神经浸出液的制备及对PC12细胞神经样分化的影响无菌采集的大鼠

7、坐骨神经通过剪碎、浸泡、过滤制备出神经浸出液，待用。为了初步验证本实验室制备的神经浸出液具有促进前体细胞向神经样细胞分化的潜能，本研究选择PC12细胞作为前体细胞模型，将制备好的神经浸出液代替PC12细胞的培养基，观察PC12细胞轴突分化情况。对神经浸出液培养第3、6、9d的PC12细胞轴突长度进行测量统计，并检测神经元标志物β3-tubulin和MAP-2的表达。结果显示，神经浸出液培养的PC12细胞明显长出突起，第3、6、9d的轴突平均长度分别达到28.07±1.76μm、58.14±2.60μm、170.43±10.08μm；神经元标志物β3-tub

8、ulin和MAP-2蛋白呈阳性表达，初步证实神经浸出液具有诱导前体