人脂肪间充质干细胞向雪旺细胞的诱导分化及对外周面神经损伤修复的实验研究

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1、中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文学校代码：10023学号：B2010001071博士研究生毕业(学位)论文人脂肪间充质干细胞向雪旺细胞的诱导分化及对外周面神经损伤修复的实验研究所院：北京协和医院姓名：李阳指导教师：高志强导师小组：姜鸿吕威陈兴明吴海燕学科专业：耳鼻咽喉科学研究方向：面神经疾病完成日期：2013年4月13日中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学击中文摘要英文摘要目录第一部分人脂肪间充质干细胞向雪旺细胞的诱导分化1、前言2、材料与方法一——一一63、结果与分析4、讨论5、结论6、参考文献第二部分诱导后的人脂肪间充质干细胞体外

2、功能检查1、前言2、材料与方法3、结果与分析1722242930364、讨论一——一——————一一一405、结{仑一——一————————一—426、参考文献一一————一——一一42第三部分诱导后的人脂肪间充质干细胞修复外周面神经损伤的研究1、前言一——一——一——————一—452、材料与方法————————一——————一463、结果与分析4、讨论51585、结论一——一————一——⋯一一606、参：考文献一————一————一60论文综述1、摘要⋯一————————————一642、正文一一————————一————一一644、参考文献缩略

3、语表发表文章致谢71818384中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文人脂肪来源间充质干细胞(hASCs)向雪旺细胞的诱导分化及对外周面神经损伤修复的实验研究中文摘要研究背景由创伤、肿瘤切除、医源性损伤等引起的面神经损伤是耳鼻咽喉科常见的疾病，严重影响患者面部功能、社会功能和心理健康。虽然修复面神经损伤的方法多种多样，但修复的效果并不理想，常伴有面肌痉挛、联带运动等并发症。雪旺细胞(schwanncells，SCs)是外周神经的主要支持细胞和髓鞘形成细胞，在神经再生中起重要作用，以SCs为种子细胞的组织工程桥接方法能明显促进神经损伤损伤后的修复

4、，但获取雪旺细胞必须牺牲其他正常神经，而且无法短时间获取大量的细胞，临床应用受到限制。脂肪来源间充质干细胞是一群具有自我更新和多系分化潜能的干细胞，具有临床应用潜在价值。通过对各种环境调节因子的应答，啮齿类动物脂肪来源间充质干细胞可分化为形状、表型、功能都类似于SCs的细胞(SC．1ikecells)，但人脂肪来源间充质干细胞(hASCs)向SCs的定性诱导分化及对外周神经的损伤和修复罕有报道。研究hASCs向SCs的诱导分化可以更全面的掌握人体干细胞的转化过程及其在损伤修复中发挥的作用，为未来干细胞真正应用于临床治疗奠定基础。研究目的探讨hASCsN

5、雪旺细胞的诱导分化的可行性，及对大鼠面神经颊支6mm损伤缺损进行修复的疗效评价。研究方法第一部分，采用化学试剂结合细胞因子，对hASCs进行SC定向诱导。以人SCs作为参照，对诱导后的hASCs(d．hASCs)行免疫荧光染色、qRT-PCR和westemblotting检测SCs标志基因；第二部分，通过qRT．PCR和ELISA比较hASCs、d-hASCs、SCs分泌神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)、神经营养蛋白(NT3)的差异；hASCs、d-hASCs、SCs与脊髓背根神经元(DRGN)、NGl08．15细胞非接触共培养，

6、荧光显微镜下测量NG．108细胞轴突的长度、密度；第三部分，建立大鼠面神经颊支6mm缺损模型，以hASCs、d-hASCs、SCs为种子细胞，以硅胶管为支架材料桥接神经断端，分别于术后4周行形态学功能评价、神经电生理检测和组织学观察，综合评价修复效果。中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文研究结果第一部分，经过诱导，d-hASCs形态与SCs,N以、基因水平、蛋白水平均表达S100、GFAP、P75等SCs的标志基因；第二部分，d．hASCs分泌细胞因子的水平与SCs相似，显著高于hASCs。通过体外与神经元细胞非接触共培养，d-hASCs和S

7、Csll明显增加神经元细胞轴突的数量、长度和密度。第三部分，通过建立动物模型体内实验进一步证实，d—hASCs与SCs相似，同hASCs相比，能明显促进轴突生长、髓鞘形成，促进面神经功能恢复。术后1月移植入大鼠体内的d．hASCs能大量存活并表达SCs的标记。结论本研究表明hASCsll有效的分化为功能性SCs，在体内、体外均能发挥类(以SCs的作用，有助于面神经损伤后的修复。关键词人脂肪；间充质干细胞；面神经损伤；修复；雪旺细胞；诱导分化；2中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文HumanAdipose—DerivedMesenchymalS

8、temCellsdifferentiateintofunctionalschwanncells