脂肪干细胞向雪旺细胞诱导分化及组织工程化周围神经构建的实验研究

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1、万方数据分类号：R318．08密级：学位类别：科学学位口专业学位团学校代码：1062学号：2011602291学科门类：医学又坪鼍科鼻鼍制圳§麓黼躺l端满k鼍褥●捌啜鬻S秘Y硕士学位论文MASTER’SDISSERTATIoN论文题目：脂肪干细胞向雪旺细胞诱导分化及组织工程化周围神经构建的实验研究TITLEExperimentstudyonthecommitteddifferentiationofadipose-derivedstemcellsinvitroandusedintotissue-engineeredperipheralnerVeS一级学科：临床医学二级学科：外科学

2、骨外论文作者：赵斌指导教师：马信龙教授导师组成员：李建江副主任医师天津医科大学研究生院二。一四年五月万方数据学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中-不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：建趔2日期：洌驴年婀形日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采

3、用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密口，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密函。(请在相对应的方框内打“√”)学位论文作者签名：盎邀日期：砌晦厂月铀学位论文作者签名：鹾囟＆日期：砌怍岁月馏导师签名：铷期：∥啊月询万方数据天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的：1．探讨兔坐骨神经损伤后内源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)及脑源性神经生长因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)的变化规律：并研究兔坐骨神经匀浆上清液对脂肪干细胞(adip

4、ose．derivedstemcells．ADSCs)的诱导分化作用。2．探讨低渗联合冻干技术改良制备脱细胞周围神经支架的可行性，检测其理化性能。3．探讨以改良脱细胞神经支架复合ADSCs构建组织工程化周围神经的可行性。方法：1．采用钳夹法制作兔坐骨神经损伤模型，分别于未损伤、损伤第3天、第7天及第14天取坐骨神经制备组织匀浆，采用ELISA方法检测坐骨神经匀浆上清液中bFGF、NGF及BDNF的含量。分离、培养兔ADSCs，将第3代ADSCs分别采用各组坐骨神经匀浆上清液培养，显微镜观察细胞形态变化，7天后通过实时荧光定量PCR检测其向雪旺细胞定向分化的能力。2．采用低渗联合

5、冻干技术对传统脱细胞神经支架材料进行改良，脱细胞完成后采用病理HE染色、免疫荧光及扫描电镜方法对其进行组织学评估；利用Mimics软件对其孔隙率及孔隙直径进行测量；采用EnduraTECELF3200力学仪器对其力学性能进行测试；并采用MTT法检测支架浸提液对ADSCs增殖的影响；Live／Dead染色观察细胞在支架上的活性。3．在体式显微镜下，将第3代脂肪干细胞与改良脱细胞神经支架采用显微注射法进行复合，构建组织工程化周围神经，采用HE染色、扫描电镜观察细胞在支架上生长、存活情况。同时，将上述细胞进行PKH26标记，检测PKH26标记前后细胞生物学特性；将细胞以密度l×107

6、个／ml接种至支架上，细胞支架复合物体外培养1周后，将其植入裸鼠背部皮下：体内培养4周后，采用小动物活体荧光成像系统检测体内细胞支架复合物荧光分布情况；处死裸鼠，取出细胞支架复合体，将其冰冻切片后，荧光显微镜下观察。结果：1．坐骨神经损伤后bFGF、NGF及BDNF的分泌均随损伤后时间的变化而波动，均于第3．7天达到峰值，之后下降：ADSCs体外培养呈长梭形，增殖迅速，稳万方数据天津医科大学硕士学位论文定性好，经损伤坐骨神经匀浆上清液诱导后具有雪旺细胞样形态；荧光定量PCR显示：S．100蛋白基因表达量随着损伤时间的延长呈上升趋势，于损伤3天组及损伤7天组达到高峰(尸<0．05

7、)，之后缓慢下降。2．HE染色及扫描电镜观察显示支架内髓鞘、细胞及轴突等结构均消失，可见平行排列的基底膜管；支架孔隙率为49．3％±9．8％，孔隙直径为(17．6+3．7)lxrn；支架弹性模量为2．45±0．65MPa；经MTT测定支架浸提液对细胞的增殖无影响；Live／Dead染色可见细胞在支架上生长良好。3．PKH26能有效标记ADSCs，标记率为95．12％，MTT检测及成骨、成脂、成软骨诱导结果显示，PKH26标记对细胞增殖及多向分化潜能没有影响；细胞支架复合物裸鼠皮下培养4周后，