细胞生物学3细胞生物学研究方法

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1、基因敲除基因敲除示意图（1）基因敲除示意图（2）基因敲除原理KnockoutMice未来的生物技术CaenorhabditiselegansDrosophilamelanogasterArabidopsisthalianaC.elegansZebrafish免疫胶体金技术基本原理：氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶状溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金标记：实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的过程。吸附机理：因胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸值被各

2、种不同颜色的胶体金颗粒。应用：胶体金粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽聚合物等结合，因而在基础研究和临床试验中成为非常有用的工具。免疫胶体金标定(Immunogoldlabeling)利用了胶体金颗粒具有高电子密度的特性，在蛋白质与金粒子结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒。因此，可以观察蛋白质的分布区域。在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。培养中的细胞不受体内复杂环境的影响，人为改变培养条件(如物理、化学、生物等外界因素的变化)即可进一步观察细胞在单因素或多因素

3、的影响下的生理功能变化。细胞培养人的细胞培养细胞系:原代培养物经首次传代成功后即为细胞系，有无限的传代能力。细胞株:通过原代培养或经过细胞克隆与选择而建立的、具有特异的性质或标记的细胞系，但是它们具有有限的传代能力。原代培养：是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质植物组织培养植物原生质体培养植物组织培养外植体愈伤组织新植株来源于细胞，而不具有完整的细胞结构，但包含了进行正常生物学反应所需的物质(如供能系统和酶反应体系等)组成的体系即为非细胞体系近年来．非细胞体系在研究DNA复制、RNA转录、蛋白质合成、

4、高尔基体的膜泡运输机制以反细胞核装配(包括染色质装配、核膜装配及核骨架的装配)等。概念流式细胞术（FlowCytometry，FCM）利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。流式细胞仪（FlowCytometer)集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。原理：将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品

5、高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。FluorescenceActivatedCellSorting488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector细胞分选细胞标记染色体分选染色体标记FACSAria科研型特点：分辨率高选配多种波长和类型激光器可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板）适用于高速分选和多色分析流式细胞仪检测范围细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞结构特异

6、性抗原（细胞表面/胞浆/核）细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体细胞功能流式细胞仪的工作原理光学系统激光光源光收集系统液流系统流动室液流驱动系统电子系统光电转换数据处理系统细胞分选系统细胞工程技术是细胞生物学与遗传学的交叉领域，主要利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术。包括体外大量培养和繁殖细胞，或获得细胞产品、或利用细胞体本身。主要内容包括：细胞融合、细胞生物反应器、染色体转移、细胞器移植、基因转移、细胞及组织培养。细胞工程在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基本过程包括

7、细胞融合形成异核体(heterokaryon)、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。细胞融合聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程显微镜下细胞融合过程BHK-21细胞用核骨架蛋白抗体进行免疫胶体金标记的结果IF：中间纤维；g:金颗粒；N:核区外周血血细胞扫描电镜标本的制备取血----PBS洗三次----滴片(有Formvar膜)----冷的1%戊二醛4度固定2小时-----PBS----1%四氧化锇，30分-----